[发明专利]产肠毒素金黄色葡萄球菌α－溶血毒素缺失菌株及其构建

权利要求书

1. 一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株，其特征在于：是通过同源重组的方法将产肠毒素的野生型菌株的α-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。

2. 根据权利要求1所述的缺失菌株，其特征在于：所述产肠毒素的野生型菌株为金黄色葡萄球菌，菌种保藏号为：CGMCC0165，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

3. 根据权利要求2所述的缺失菌株，其特征在于：所述缺失菌株可按如下步骤制备，

1)利用PCR技术扩增得到α-溶血毒素基因上游同源序列Hla-u和下游同源序列Hla-d，以及替换基因Neor；并将Hla-u、Hla-d、Neor连接得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd；

2)将Hu-Neor-Hd片段克隆入载体pMAD，经PCR扩增和酶切验证得到基因敲除载体pMHL-α，然后将pMHL-α载体转化进金黄色葡萄球菌RN4220进行基因修饰；

3)将基因修饰过的基因敲除载体pMHL-α通过原生质体转化导入产肠毒素野生型金黄色葡萄球菌CGMCC0165细胞内，通过培养，筛选得到产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株。

4. 一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株的构建方法，其特征在于：可按如下步骤操作，

(1)根据Genbank已公开的金黄色葡萄球菌α-溶血毒素基因序列，设计两对引物，分别为：Hla-uF 5’CGCGGATCCATCGATTACATTT3’，Hla-uR5’CGGAATTCTGAGCTGACTATACGTG3’；Hla-dF5’CTACTCGAGGTATATGGCAATCAAC3’，Hla-dR5’CGCGGATCCCCTCTATAGTGTCATG3’；以产肠毒素的野生型菌株基因组DNA为模板，用引物Hla-uF，Hla-uR进行PCR扩增得到与α-溶血毒素基因上游序列同源的基因片段Hla-u；用引物Hla-dF，Hla-dR进行PCR扩增得到与α-溶血毒素基因下游序列同源的基因片段Hla-d；

(2)根据Genbank中公开的已知新霉素抗性基因序列，设计一对引物：上游引物为5’GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3’，下游引物为5’ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3’；以载体pcDNA3.1为模板，PCR扩增得到新霉素抗性基因Neor；

(3)基因敲除载体pMHL的构建：将以上步骤(1)和(2)中扩增得到的基因片段Hla-u、Neor、Hla-d进行酶切后连接，得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd，然后将此连接片段克隆入载体pMAD、转化，经质粒抽提、PCR扩增及酶切鉴定，构建得到基因敲除载体pMHL-α；

(4)基因敲除载体pMHL-α的基因修饰：将载体pMHL-α通过电转化导入金黄色葡萄球菌缺陷菌株，经过培养抽提质粒，PCR扩增及酶切鉴定，获得经过基因修饰过的敲除载体pMHL-α；

(5)载体pMHL-α介导的基因敲除：载体pMHL-α通过原生质体转化的方法导入产肠毒素的野生型菌株内，构建得到产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株。

5. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)和(5)中用于产肠毒素野生型菌株为金黄色葡萄球菌，菌种保藏号：CGMCC0165，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。