[发明专利]一种检测土壤反硝化酶活性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤中反硝化酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中反硝化酶活性的分析方法。

背景技术

土壤中的反硝化酶能将在土壤氮代谢过程中形成的硝态氮还原生成亚硝态氮或者氮气或一氧化氮，土壤中的还原态化合物可作为氢的供体。

因此，土壤中反硝化酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的气态损失，间接影响氮肥的利用效率。土壤中反硝化酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中反硝化酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关反硝化酶活性的测定基本都是参照Jordan T E et al(1998)和White J R et al(1999)的方法。该种方法步骤比较繁琐，需用专用分析设备，试剂瓶和抽滤装置进行抽真空培养，且培养批次的不同具有差异性和不确定性，使其难以适应土壤中反硝化酶活性的定性比较和定量研究；同时，该种方法样品的前期处理比较麻烦，降低了实验的效率，增加了实验结果的不准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检验土壤中反硝化酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对反硝化酶活性的测定步骤和显色方法进行了部分改进(对其样品的处理方法和测定方法进行改进)，从而减少样品处理和试验步骤的复杂性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测土壤中反硝化酶活性的分析方法，

1)称取0.5-1g过1-1.5mm筛的土壤风干样品n份分别装入n支试管中，n≥2，向其中n-1支试管中加入5-15mL 5g/L-15g/L的底物KNO₃溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；然后向试管中分别加入1-2mL重量浓度0.5％-1％的葡萄糖溶液作为氢的供体，用蒸馏水补充至15-20mL，摇匀，塞上不透气的橡胶塞后37℃恒温培养48h；同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)；

2)培养结束后，3900-4100r/min离心20-25min；

3)用紫外分光光度法分别测定吸光度A₂₂₀，A₂₇₅；

4)求出校正吸光度A＝A₂₂₀-A₂₇₅；

5)制作工作标准曲线，以硝酸根溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；

6)根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中硝酸根的浓度S，S＝A*b；

7)计算样品中硝酸根浓度；

8)计算反硝化酶活性：

计算公式为：[S₁-(S₂-S₃)*V/1000]/W.T＝mgNO₃^--N/g土·48h

式中：S₁为试剂空白中的NO₃^--N的含量(mg)，S₂为样品中的NO₃^--N的含量(mg/L)，S₃为样品对照中的NO₃^--N的含量(mg/L)，V为浸提液总体积(mL)，W为称土样重(g)，1000为单位转换系数，T土样培养时间(h)。

对于酸性土样品，分析前应调解其pH为7-8.5，可采用加入碳酸钙的方法调解，每支试管中分别加入15-25mgCaCO₃，混匀向其中n-1支试管中加入5-15mL 5g/L-15g/L的底物KNO₃溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照。(对于石灰性土壤而言，碳酸钙无需加入，因为土壤本身的pH值既可以满足微生物的最适pH)

制作工作标准曲线过程为：吸取硝酸根标准溶液0mL，0.5mL，1mL，2mL，3mL，4mL，5mL分别放于100mL容量瓶中(如有沉淀过滤)用蒸馏水定容，用紫外分光光度计测其吸光度A’，以硝酸根溶液的系列浓度0mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L，5mg/L和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b。

本发明方法改进的依据