[发明专利]液相半乳糖氧化酶希夫测定法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用氧化剂和醛检测试剂如半乳糖氧化酶和希夫(schiff)试剂 来检测癌或癌前病变的改良的检测方法。本发明还关于包含执行本发明的方法所需 部件的试剂盒。

技术背景

半乳糖氧化酶希夫(GOS)试验用来检测表达在癌或癌前病变中的糖蛋白的糖 类标记物(如D-半乳糖[Gal]，或N-乙酰-D-半乳糖胺[GalNAc]，或D-Gal-β-[1→3]-N- 乙酰-D-半乳糖胺[GalGalNAc]二糖[T或Thomsen-Friedenreich(TF)抗原])。这些标 记物可能发现位于直肠粘液(结肠癌)、唾液或痰(口腔癌、肺癌)、乳头溢液(乳腺癌)、 其他粘液分泌物(阴道分泌液[宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌])，精液[前列腺癌])和 血液(多种癌症)。Shamsuddin(美国专利第5,348,860号)公开了一种检测标记物的方 法，包括用GOS处理之前将粘液样品吸附到一种俘获蛋白质且不溶于水的底物上 (如薄膜滤器)。用GOS处理之前的样品固定这一先决条件有几个缺陷：1)使临床样 品固定的烘干阶段2)半乳糖氧化酶(GO)孵育后的漂洗和希夫试剂孵育后更大量的 冲洗，以减少非特异性反应产物产生的背景，同时分别去除多余的酶和显色剂3) 吸附的样品的手工处理4)对结果主观视觉上的解释。现有技术的另一个缺陷是， 为了检测糖蛋白和验证样品在固相上的存在，GOS程序之后使用了过碘酸-希夫试 剂。

第10/877,737号的美国专利申请书公开了一种以颜色属性如色彩和/或色度为 根据，产生定量和半定量结果的方法，该方法部分地减少视觉评分的主要缺点，即 需要一个熟练的、经验丰富的分析者。然而这个程序是以分光光度计的反射比以及 在可见光谱范围内多重读数得到的信息进行计算的算法为根据。分析需要一个专门 的仪器，在诊断社区一般是没有的。

因此，本领域需要改进使用GOS测定法检测肿瘤的方法。

发明概述

本发明提供一种使用氧化剂和醛检测剂如半乳糖氧化酶和希夫试剂检测受试 者癌或癌前病变的改良的方法，该方法不需要将受试者样品固定到固相载体上。代 替的是，本发明提供一种改良的方法，其中样品可以直接在液相系统中与氧化剂和 醛检测剂反应而不需要固定到固相上。另外，程序中结合了一个阳性对照如半乳甘 露聚糖(guar)以确保氧化剂和醛检测剂的活性。

本发明具有优于现有技术的一些优点。本发明容许直接在液相系统中处理样 品和氧化剂和醛检测剂如半乳糖氧化酶和希夫试剂。例如，本发明容许胶状样品如 痰的化学分裂或分散，以确保和氧化剂如半乳糖氧化酶的可混合性。本发明比以薄 膜为基础的测定法有试验时间明显减少的优点。因此，本发明有分析出报告时间减 少的优点。另外，和视觉的、非客观的结果解释相比，本发明的方法基于用标准实 验室分光光度计或微板读数仪测到的预定波长处的吸收，提供一个客观的、半定量 的测量结果。本发明的优点在于，能够实现容高通量筛选的自动操作和批量处理。 这点对于群体筛选特别有利。例如，使用本发明的方法能很容易筛选全部人群或部 分人群的癌或癌前病变。另外，本发明方法容许预先测定样品，以消除由于缺少样 品固定导致的有关潜在的假阴性的不确定性，并避免了为验证样品存在的试验后处 理的需要(如高碘酸盐氧化，然后是希夫试剂)。本发明的方法有更好的临床性能的 潜力。

因此，本发明一方面检测受试者癌或癌前病变的方法，其中，测定受试者样 品以确定在癌或癌前细胞相关样品中糖类标记物的存在，所述方法包括以下步骤：

(a)提供受试者样品；

(b)混合样品和氧化剂，所述氧化剂能将糖类标记物上的敏感C-6羟基氧化为 醛；

(c)添加醛检测剂到混合物中，在醛的存在下混合物产生比色变化；和

(d)检测液相系统中的比色变化，其中，醛检测剂产生的比色变化指示了癌或 癌前细胞相关糖类标记物的存在。

本发明另一方面是检测受试者癌或癌前病变的方法，其中，测定受试者样品 以确定癌或癌前细胞相关样品中糖类标记物的存在，所述方法包括以下步骤：

(a)混合样品和氧化剂，所述氧化剂能将糖类标记物上的敏感C-6羟基氧化为 醛；

(b)添加醛检测剂到混合物中，在醛的存在下混合物产生比色变化；和

(c)检测液相系统中的比色变化，其中，醛检测剂产生的比色变化指示了癌或 癌前细胞相关糖类标记物的存在。