[发明专利]用于标记或处理包含目的生物分子特别是核酸的生物样品的方法

说明书

本发明涉及用于纯化包含已被标记的目的核酸(合成或天然的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))的生物样品的新方法。

术语“合成的RNA或DNA”应当理解为是指通过由人开发的技术例如扩增技术(PCR，然后任选地转录)或转录扩增技术(TMA或NASBA)而获得的RNA或DNA。术语“天然的RNA或DNA”应当理解为是指通过细胞的提取而获得的RNA或DNA，例如信使RNA、核糖体RNA、转运RNA或基因组DNA。

现有技术显示，存在许多用于标记这些核苷酸、寡核苷酸或核酸的方法。寡核苷酸和核酸在下文中都称为多核苷酸。可在合成期间，或者通过整合至少一个经标记的核苷酸来进行标记。

第一种方法包括将标记附着至碱基上，无论碱基是天然的还是经修饰的。第二种方法提出将标记物附着至糖上，同样无论糖是天然的还是经修饰的。第三种方法的目的在于将标记物附着至磷酸上。

特别地，已将在碱基上进行标记用于通过整合直接经标记的核苷酸来标记核酸的方法。

通常在通过化学合成来制备核酸探针的情况下使用在糖上进行标记。

也已将在磷酸上进行标记用于在寡核苷酸的化学合成期间导入官能化的臂和标记物。

事实上，必须进行核苷酸或核苷酸类似物或多核苷酸的标记的本领域技术人员倾向于在碱基或糖上进行该附着，这为他们提供更大的方便和更多的选择。此外，这是出自许多参考文件的研究，例如对于碱基有EP-A-0,329,198、EP-A-0,302,175、EP-A-0,097,373、EP-A-0,063,879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3,910,151、EP-A-0,567,841，或对于糖有EP-A-0,286,898。

标记物与磷酸的结合是比包括官能化碱基或糖的技术更复杂的技术，并且使用范围更窄，这特别是由于磷酸的低反应性(参见，例如，Jencks W.P.等人J.Amer.Chem Soc.82，1778-1785，1960)。类似地，在由O’Donnel和McLaughlin发表的涉及将探针导入寡核苷酸片段中的方法的综述(“Reporter groups for the analysis ofnucleic acid structure”，p216-243，在“Bioorganic Chemistry：Nucleic Acids”，Ed Hecht S.M.Oxford University Press，1996中)中，核苷酸之间的磷酸二酯的有效烷基化被认为是不可能的。

本申请者已开发了基于新试剂的标记技术，所述试剂从标记产率的观点来看是有效的，所述试剂就标记的位置来说具有特异性，并且特别是所述试剂不影响参与通过氢键来形成双螺旋的碱基的杂交特性，所述试剂可同时用于DNA和RNA，并且，最终所述试剂使得能够无差别地标记天然的多核苷酸或通过酶促扩增而制备的多核苷酸。

因此，专利申请WO-A-02/090319描述了许多标记物，其满足上述条件并使用重氮基甲基官能团作为用于标记的反应性官能团。重氮基甲基官能团(式-C(N₂)-)已被用于磷酸基团的烷基化，但存在一定数量的问题。一方面，重氮基衍生物自身通常是不稳定的，这对于在标记试剂盒中使用这些标记试剂产生了问题，和另一方面，偶联产物是不稳定的，如果经标记的产物的功能是证明任何样品中生物靶分子的存在，那么这是完全无法接受的。最后，具有重氮基甲基官能团的衍生物是不溶于水的，这导致使用两相条件来与仅在水或水性缓冲液中可溶或稳定的生物分子进行偶联，但这些条件减慢了反应速率，从而使偶联效率受到损害。描述于申请WO-A-02/090319中的那个发明的新型标记试剂也解决了这些技术问题。根据一个实施方案，温度稳定性标记试剂具有下式：

其中：

·R¹表示H或烷基、芳基或取代的芳基，

·R²表示可检测的标记物或至少两个通过至少一个多聚体结构相互连接的可检测标记物，

·L是包含线性链接的至少两个共价键的连接臂，n是等于0或1的整数，

·R³和R⁴相互独立地表示：H、NO₂、Cl、Br、F、I、R²-(L)_n-Y-X-、OR、SR、NR₂、R、NHCOR、CONHR、COOR，其中R＝烷基或芳基，