[发明专利]检测尿液中病毒特异性核酸的组合物和方法

说明书

发明背景

目前存在三种类型的体外诊断系统，广泛用于检测病原体。这些 是生物样品的病原体的直接培养；基于传染剂产物或抗原检测的免疫 测定；和可以检测传染过程中对抗传染剂产生的抗体的间接免疫测 定。

在第一个系统中，主要缺陷是认为生物样品存在传播病原体的危 险。在第二个和第三个系统中，缺陷包括样品提取，这通常是入侵性 的并在收集时可能是传染性样品。在第三个系统中，一个主要的缺陷 是在过去和现在传染之间通常存在很小的区分可能性。

最近，基于取自个体的血液或血浆样品，或细胞培养物中的病原 体核酸检测，已经产生了分子诊断方法。这些测定通常比免疫测定灵 敏得多。然而，它们需要特定设备和专业人员的存在。此外，生物样 品——在血浆、血液或细胞培养物的情况中——难以存储而没有发生 变化，除非在受控的温度条件下，并且认为对操作人员是有生物危害 性的。

最近，已经描述了基于跨肾(transrenal)DNA(Tr-DNA)的分 子诊断方法，用于监控异源移植的进展、诊断胎儿的性别和检测肿瘤 标记的存在。(Botezau等，Clinical Chemistry 46(8)：1078-84(2000)； Su等，Ann.NY Acad.Sci.1022：81-89(2004))。例如，U.S.专利 No.6,251,638描述了在怀孕妇女尿液中检测男性胎儿DNA的分析方 法。U.S.专利No.6,287,820描述了目的在于诊断肿瘤的系统，特别是 结肠和胰腺的腺癌。U.S.专利No.6,492,144教导了可以用于监控异源 移植进展的Tr-DNA核酸分析方法。A1-Yatama等(2001)中，Prenat Diagn，21：399-402；和Utting，M.等(2002)，Clin Cancer Res，8： 35-40。Keiko Koide，等，Prenat Diagn，2005；25：604-607；Mengiun Wang，等，Clinical Chemistry，2004，50：211-213；Y.-H.Su，等，J. Mol.Diagn.，2004，6：101-107中还描述了跨肾DNA以小于1000个 碱基对的核酸片段的形式存在于尿液中。

已经将跨肾DNA的存在解释为凋亡现象的结果。在凋亡或程序 化细胞死亡的过程中，核DNA分裂成核小体和寡聚物，其随后，作 为凋亡过程的一部分，被吞噬并从生物体中排出。(Umansky，S.R.， 等(1982)；Biochim.Biophys.Acta，655：9-17)。尽管该降解DNA 的一部分避开了吞噬作用，但出现于血流中(Lichtenstein，A.V.等 (2001)，Ann NY Acad Sci，945：239-249)，并且，如上述提及的专 利中所证实的，也存在于尿液中。

在本申请之前，还没有描述尿液中存在来源于尿道外来源的病毒 DNA。已经表明了从血浆中转染细胞基因组释放的病毒DNA的循环。 例如，在鼻咽癌个体的血浆中检测到EB病毒DNA的片段(Chan，K. C.，等(2002)，Cancer Res 63：2028-2032)。此外，在宫颈癌个体的 血浆中已经检测到人乳头状瘤病毒(HPV)的病毒DNA (Pornthanakasem，W.，等(2001)；BMC Cancer 1：2)。然而，在个 体尿液中没有检测到这些病毒DNA。

本发明描述了通过检测个体尿液中那些病原体的DNA序列来检 测个体中病毒病原体存在的方法。

发明概述

本发明涉及通过检测和定量个体尿液中跨肾病毒(transrenal virus)核酸特异性序列来诊断和监控个体病毒感染的方法。一实施方 案中，核酸是分离的或纯化的。可以使用化学或物理方法来进行该纯 化。这些方法包括有机溶剂提取、过滤、沉淀、具有核酸亲和性的固 体基质的吸附和色谱。这些方法中使用的固体基质可以由硅胶基的树 脂、离子交换树脂或羟磷灰石构成。另一个实施方案中，固体基质是 硅胶基树脂，且所述分离和纯化在离液剂(chaotropic agent)存在下 进行。另一个实施方案中，将一种或多种抑制核酸降解的试剂加入尿 样中。这些试剂包括离子螯合剂、变性剂和离子去污剂。本发明方法 中使用的离子螯合剂实例是EDTA。本发明方法中使用的变性剂实例 是盐酸胍或异硫氰酸胍。本发明方法中使用的离子去污剂实例是N-月 桂酰肌氨酸或十二烷基硫酸钠。一实施方案中，将分离或纯化的核酸 用于病毒核酸的检测。