[发明专利]抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，具体地说本发明关于一种抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒及检测方法。

背景技术

α-干扰素(IFN-α)是目前国际公认的治疗慢性乙型肝炎的有效药物之一，慢乙肝患者IFN-α治疗6-12个月后，ALT复常率为34％至45％，HBeAg消失/抗HBe出现率约为15％至37％，HBV-DNA转阴率(低于105拷贝/ml)为37％，HBsAg转阴率约为1％-8％。导致慢乙肝患者在干扰素治疗之后取得持续性应答、部分应答或者无应答的原因是临床医生非常关心的问题，与干扰素应答密切的因素包括治疗前高ALT的水平、治疗前低HBV-DNA的载量和肝脏组织学明显的炎症活动。其他与干扰素应答相关的因素还包括感染后病程短、有急性肝炎过程、女性、无HCV/HIV/HDV合并感染、HBeAg阳性。另外，成年后感染HBV者其干扰素的疗效明显高于母婴传播的HBV患者。众多的研究表明在亚洲流行的B型患者干扰素疗效优于C型，而A型疗效优于D型，前C区1896位变异与干扰素疗效密切相关。干扰素治疗早期病毒学应答HBeAg、HBV-DNA下降以及肝脏内cccDNA的含量、HBcAg含量对预测干扰素疗效具有重要的意义。

MxA表达在慢乙肝中具有重要的临床意义。Leifeld L等发现在暴发型肝衰竭患者肝脏MxA的表达明显高于慢乙肝患者，Fernandez M等研究发现IFN-α刺激后MxA应答在慢乙肝患者中明显低于健康对照，而且HBV-DNA滴度高的患者MxA的应答更弱。King JK等收集慢乙肝干扰素治疗有应答者46名和无应答者36名，对干扰素信号传导途径中的22个单个核苷酸多态性进行分析，发现MxA-88为G/T杂合子在干扰素应答组中占43％，而无应答组为19％，杂合子率在有应答组高于无应答组。目前上海基康生物技术有限公司其网站和销售人员提供乙型肝炎干扰素疗效预测的检测，其理论根据来源于60例丙型肝炎患者300多个干扰素诱导基因SNP分析的结果，选择主要的5个基因的19个SNP进行基因分型，并对其方法做出有效的患者进行干扰素治疗，在这部分患者干扰素的有效率是60％，明显高于临床所观测到的干扰素疗效，但目前为止未见公开发表或国内外专利。

目前对干扰素疗效的预测判断主要来自于临床医生对患者各方面临床指标的考虑，如性别、年龄、ALT、HBV-DNA、HBeAg等，但是这些判断缺乏准确性、客观性、不能提高受治疗患者的有效率。上海基康公司推出的SNP预测干扰素疗效由于缺乏公开文献，也无法进行客观的评价。但是利用SNP进行疗效预测普遍存在的问题是人群的复杂性以及其SNP分布只有三种基因型，而分布频率可能影响其在人群整体中的价值，如MxA-88G/T SNP与干扰素疗效相关，但是其倾向于有效的T等位基因在中国人群中的频率只有10％，这样排除了大部分可能有效的患者进行治疗的可能。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)提供一种抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒；

(2)提供一种利用抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：

一种抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒，包括：MxA和管家基因GAPDH扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种。

其中，MxA：正向引物：-2040F：5’GTCCAGCTCGGCAACAGACT3’，(见SEQ1)，反向引物：-2157R：5’CATGAAGAACTGGATGATCAAAGG3’(见SEQ2)，探针：-2093T：5’FAM-CCTATCACCAGGAGGCCAGCAAGCG3’TARMA；(见SEQ3)，GAPDH：正向引物：-81F：5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3’，(见SEQ4)，反向引物：-287R：5’GAAGATG GTGATGGGATTTC3’，(见SEQ5)探针：-258T：5’FAM-CAAGCTTCCCGTTC TCAGCC3’TARMA(见SEQ6)；其中抗病毒基因MxA序列(见SEQ7)；

所述的PCR缓冲液中含有1X Buffer，2mM MgCl₂，200μM dNTP，1UTaq酶，正反向引物均500nM，探针为200nM。

一种利用抗病毒基因MxA荧光定量试剂盒检测方法，包括以下步骤：

(1)、采集外周血单个核细胞PBMC；

(2)、干扰素刺激PBMC细胞；