[发明专利]小麦印度腥黑穗病菌的检测引物、探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小麦印度腥黑穗病菌的检测引物及探针；此外，本发明还涉及使用该引物和探针检测小麦印度腥黑穗病菌的方法。

背景技术

小麦印度腥黑穗病菌Tilletia indica Mitra是世界关注的危险性有害生物，也是我国对外公布的一类危险性有害生物，主要分布在印度、巴基斯坦、伊朗、伊拉克、尼泊尔、阿富汗、巴西、墨西哥、美国和南非等地。近年来随着粮食市场的开放，进口粮食数量的不断增加，增加了小麦印腥传入的机会和风险，特别是主要粮食出口国美国也有小麦印度腥黑穗病菌的发生，给我国口岸检疫带来小麦印度腥黑穗病菌检测的新难题。目前常用的检测和鉴定方法是形态特征鉴定和常规PCR技术。形态特征鉴定需要丰富的经验和一定数量的病菌冬孢子。传统的PCR检测方法是先萌发孢子，繁殖菌丝，提取DNA，PCR检测，整个检测过程一般为20-30天。如果直接检测孢子，从孢子中提取DNA再PCR检测，需要的孢子量比较大，在实际的检测过程中难以得到大量的孢子，而且实际的样品中可能存在几种病菌孢子。常规PCR技术需要冬孢子萌发培养繁殖得到菌丝，整个处理和鉴定的过程长达2-3周，而且冬孢子休眠和不具存活力也影响病菌的鉴定。因此以上两种鉴定方法的实用性受到一定的限制。

Frederick等(2000)报道了利用TaqMan探针的小麦印度腥黑穗病菌实时荧光PCR检测方法。章桂明等(2002)也建立了小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光PCR检测方法(未发表)。已报道的实时荧光PCR方法的探针都是针对小麦印度腥黑穗病菌的线粒体序列，而线粒体序列的变异速率比核糖体序列变异速率更大，核糖体序列更为保守和稳定。

MGB方法是在Taqman方法之后产生的更新的方法，其全称为MinorGroove Binder。与TaqMan探针相比，其原理是TaqManMGB探针一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记；二是探针的3’端另结合了Minor groove binder结合物，使探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。该方法具有如下优点：1、更容易设计；2、探针更短：3、提高配对与司E配对模板间的Tm值差异；4、实验结果更精确、分辩率更高；5、杂交的稳定性提高；6、低背景；7、重复性更强。该方法适合病原体的检测、SNP和突变体检测，既可以进行基因定量分析，又可以进行基因突变分析。

动植物检疫部门、农业生产部门、植物保护、真菌研究部门等单位往往在进出境或田间所取的样品中往往获取的孢子量很少，有时甚至仅有1个、几个或极微量的孢子，因此，现有的方法不能满足动植物检疫检测部门、农业生产部门、植物保护部门及真菌科研部门对小麦印度腥黑穗病菌检测的需要。因此，针对核糖体序列设计小麦印度腥黑穗病菌的特异性探针，建立小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定的目的，就显得非常重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种小麦印度腥黑穗病菌的检测引物。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种小麦印度腥黑穗病菌的检测探针。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种使用上述引物和探针检测小麦印度腥黑穗病菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一方面，提供一种小麦印度腥黑穗病菌检测引物，其序列为：5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明还提供一种小麦印度腥黑穗病菌检测引物，其序列为：5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)。

在本发明的另一方面，提供一种小麦印度腥黑穗病菌检测探针，其序列为：5’(FAM)-CGGAAGGAACGAGGC-3’(MGB)(SEQ ID NO.4)。

在本发明的另一方面，还提供一种小麦印度腥黑穗病菌的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取冬孢子DNA；

(2)设计引物和探针，上游引物：5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ ID NO.2)，下游引物：5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)，探针：5’(FAM)-CGGAAGGAACGAGGC-3’(MGB)(SEQ ID NO.4)。