[发明专利]利用重组酶/转座酶的改进的DNA免疫法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA疫苗和佐剂领域。特别地，本发明涉及改进的利用包含表达盒的载体免疫/接种包括人类在内的动物或刺激其免疫系统的方法，所述表达盒编码一种或多种蛋白质/多肽抗原和/或佐剂以及介导DNA整合到动物的基因组里的重组酶。本发明还涉及包含新多肽—兔GMCSF的佐剂组合物，用于提高兔体内的抗体产量。

背景技术

利用疫苗免疫动物需要蛋白抗原的可重复生产，这是比较困难和昂贵的。免疫使用生物体、毒素或抗原的全部或者通常其部分来进行。为了在宿主体内维持一定水平的免疫性，需要施用高剂量的抗原，或者大多数情况下，需要施用重复剂量的抗原。另外，疫苗的开发严重受限于可在动物体内引发可用反应的有用抗原的可得性。利用佐剂来增强动物体内的免疫反应在本领域内是公知的。已有多种类型的佐剂得以应用，例如，矿物油或含油佐剂，如完全弗氏佐剂(FCA)、不完全弗氏佐剂、Ribi佐剂、Titermax等；来源于细菌的佐剂，如MDP(胞壁酰二肽)、脂质A、脂多糖(LPS)等；无机化合物，如磷酸铝、氢氧化铝和磷酸钙等；脂质体，与膜蛋白抗原复合的皂苷(免疫刺激性复合物)等等。多数佐剂有毒或引起轻度至重度的副作用，但也有一些只在宿主体内引起很弱的免疫反应。因此，开发安全和有效的佐剂是一项持续的挑战。佐剂开发中的一种较新的方法是利用生物免疫刺激性佐剂例如细胞因子作为佐剂。

基因免疫或称DNA免疫在本领域中是已知的，它利用编码目的抗原蛋白的基因或者DNA，而不是以多肽本身作为免疫原的来源。它基于制造容易、成本便宜的原料，还可以重复性地生产。宿主细胞摄取引入的DNA，并且通过正常的细胞机制表达编码的抗原。然后抗原与I类和II类MHC分子一起呈递在细胞表面上，在那里与免疫活性细胞接触，引起免疫反应。这样，无需增加最初的疫苗中抗原的量，也不需要反复地施用疫苗，免疫性的持续时间就可以延长。Manickan等，J Clin Invest 100：2371-2375(1997)报道了用编码一种单纯疱疹病毒(HSV)蛋白的裸露DNA免疫小鼠。Boyle等，Proc Natl Acad Sci USA 94：14626-14631(1997)报道了DNA免疫可诱发快速CTL反应，并且可产生比传统的蛋白免疫亲和力更高的抗体。

HIV/AIDS的DNA疫苗已经制成，并已在各种动物模型中，包括非人类灵长类中，以及人类临床试验中得到了检验。参见，例如，Robinson等，Ann NY Acad Sci Acad Sci 772：209-211(1995)；Yasutomi等，J Virol 70：678-681(1996)；MacGregor等，J Infect Dis 178：92-100(1998)。除了传染性疾病之外，人们还认为DNA免疫有可能作为癌症免疫疗法的手段(参见，例如，Srinivasan和Wolchok，J Transl Med 2：12(2004))。DNA疫苗还被推荐用于变态反应的治疗(参见，例如，Hartl等，Methods 32：328-39(2004))。

有若干因素影响DNA疫苗接种的结果，包括：免疫的方法和部位、免疫原的形式、免疫接种的给药方案、有无佐剂或生物佐剂如细胞因子的共同施用、其它共刺激分子的共同施用，DNA内有无免疫刺激序列(ISS)，等等。例如，人们观察到来自细菌而不是脊椎动物的DNA可以引起非特异性的免疫反应，这似乎是由于这两种基因组中非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)出现的频率存在差异。另外，人们发现，使用包含CpG和ISS序列的质粒DNA进行DNA接种，可以比使用不含ISS序列的相同疫苗诱导出更强的抗体和CTL反应。影响针对DNA接种的免疫反应其它重要因素有：所编码的抗原的形式，特别是抗原是否表达为细胞质蛋白或分泌蛋白；以及所编码的抗原和/或佐剂的表达水平。通常，表达的水平越高、越持久，免疫反应就越强。

通过许多不同的途径—包括静脉内、肌肉内、脾内和肝内途径—的DNA接种均已显示了成功。就抗体反应的产生而言，已经有很多研究报道说基因枪免疫接种比针注射的效率高得多，只需用少100至5000倍的DNA就可引起类似水平的抗体反应。施用DNA疫苗的最佳的给药方案(例如剂量、次数、和/或免疫接种频率)还远未确定，而且需要针对每种个别的抗原进行最优化。大多数的研究表明，为使免疫反应最大化，多次注射是必需的。