[发明专利]使用内切核酸酶剪切/连接酶重新密封反应和毛细管电泳或微阵列检测核酸差异

权利要求书

1.鉴别与一种或多种正常的核苷酸靶序列的差别在于一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核苷酸靶序列的方法，所述方法包含：

提供一种或多种样品，其可能含有正常的核苷酸靶序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列、或这两者；

提供一组一个或多个一级寡核苷酸引物集合，每个集合包含：(a)第一种一级寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分和5’上游二级引物-特异性的部分，和(b)第二种一级寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分和5’上游二级引物-特异性的部分，其中组中每个集合的第一种一级寡核苷酸引物含有相同的5’上游二级引物-特异性的部分，且组中每个集合的第二种一级寡核苷酸引物含有相同的5’上游二级引物-特异性的部分；

混合样品、一种或多种一级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或多种一级聚合酶链式反应混合物；

使一种或多种一级聚合酶链式反应混合物进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产物，其与存在于样品中的正常核苷酸和突变核苷酸靶序列互补；

提供一组一个或多个二级寡核苷酸引物集合，每个集合包含：(a)第一种二级寡核苷酸引物，其包含与第一种一级寡核苷酸引物的5’上游二级引物-特异性的部分相同的序列，和(b)第二种二级寡核苷酸引物，其包含与第二种一级寡核苷酸引物的5’上游二级引物-特异性的部分相同的序列；

混合一种或多种一级聚合酶链式反应混合物、一种或多种二级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或多种二级聚合酶链式反应混合物；

使一种或多种二级聚合酶链式反应混合物进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成二级延伸产物，其与一级延伸产物互补；

灭活聚合酶；

使一种或多种二级聚合酶链式反应混合物进行一个过程，该过程将二级延伸产物转化成单链形式，并使单链二级延伸产物退火，形成可能包含核酸分子的异双链的产物，所述核酸分子包含来自正常的核苷酸靶序列的核苷酸序列和来自突变的核苷酸靶序列的核苷酸序列；

提供内切核酸酶，其优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双链的DNA；

混合异双链的产物和内切核酸酶，形成内切核酸酶剪切反应混合物；

使内切核酸酶剪切反应混合物进行内切核酸酶剪切反应，以便内切核酸酶优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双链的产物；

提供连接酶；

混合内切核酸酶剪切反应混合物和连接酶，形成连接酶重新密封反应混合物；

使连接酶重新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应，在完美匹配的碱基对处密封切割的异双链的产物，但是基本上不在邻近错配碱基对的位置处重新密封切割的异双链的产物；

通过大小或电泳迁移率或杂交，分离所述使连接酶重新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应后得到的产物，以便捕获结合到固体支持物上的探针；和

通过辨别分离的产物，检测正常的核苷酸靶序列和一种或多种突变的核苷酸靶序列在样品中的存在。

2.根据权利要求1的方法，其中样品选自基因组DNA和肿瘤样品。

3.根据权利要求1的方法，其中靶核酸分子选自mRNA的cDNA拷贝和PCR扩增片段。

4.根据权利要求1的方法，其中样品是肿瘤样品。

5.根据权利要求1的方法，其中靶核酸分子是mRNA的双链cDNA拷贝。

6.根据权利要求1的方法，其中靶核酸分子是PCR扩增片段。

7.根据权利要求1的方法，其中同时进行一级和二级聚合酶链式反应循环。

8.根据权利要求1的方法，其中在二级聚合酶链式反应循环之前进行一级聚合酶链式反应循环。

9.根据权利要求1的方法，其中给一种或两种二级寡核苷酸引物提供标记。

10.根据权利要求9的方法，其中标记选自荧光染料，IR染料，量子染料，量子点，和放射性的基团。

11.根据权利要求9的方法，其中第一种二级寡核苷酸引物和/或第二种二级寡核苷酸引物在它们的5’末端被标记。