[发明专利]酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法及活性测定

说明书

本发明涉及一种生物工程产品的生产方法和生物活性测定领域。特别是一种在酵母中分泌表达人组织纤溶酶原激活剂的生产方法及其生物学特征的测定。

组织纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator，t-pA)是目前公认的最好的溶纤药。临床上常用于因血管栓塞所引起的心肌梗死、脑栓塞肺静脉栓塞、肾静脉栓塞、下肢深部静脉栓塞和器官移植后血管再通的治疗。

组织纤溶酶原激活剂最早是从人血液中分离纯化而获得组织纤溶酶原激活利。由于含量很少，难以大量获得。国内外虽然有采用(1)在中国仓鼠卵巢细胞--CHO中表达，(2)在大肠杆菌Ecoli中表达，(3)在酵母中表达3种途径生产组织纤溶酶原激活剂，但都存在各种问题，难以工业化生产。

酵母表达系统尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)早已广泛应用。以S.cerevisiae为代表的常规酵母表达系统虽已积累大量经验，但也存在缺陷，如生长速度慢，密度不高，外源蛋白的表达，翻译后加工和分泌不够理想，重组质粒游离于酵母染色体，在高密度发酵培养过程中，质粒易丢失而导致目的蛋白表达水平逐渐下降。近年来迅速崛起的非常规酵母表达系统部分克服了上述缺点，能高效表达外源蛋白，如Pichia pastotis,HansenulaDolymorpha,Kluyveromyces lactis，其中以Pichia pastoris表达系统最为成功。Phillips公司和SIBIA公司联合开发了甲基营养型酵母一Pichia Pastoris(毕赤巴斯德酵母)基因表达体系(1987 NucleicAcids Res.15:3859-3876)。该体系以醇氧化酶(AOXI)为启动子，通过同源双交换使外源基因稳定地整合于酵母染色体，有效的避免了外源基因丢失。毕赤巴斯德酵母不但能使表达产物糖基化，避免酿酒酵母的超糖基化作用，更重要的是它可将表达产物分沁于胞外(并非任何外源基因皆可以被分泌于胞外)，而且自身蛋白的分泌却很少，非常有利于下游的纯化制备。目前，尚未见有组织型纤溶酶原激活剂分子在酵母表达体系分泌表达的报道。

本发明的目的是通过酵母菌分泌表达、分离纯化，大量获取与天然tPA具有相同生物学活性的重组htPA分子，以利于大规模药用开发。

本发明采用的技术方案为：在获取人tPA cDNA的基础上，将其5′端序列加以修饰，克隆入分泌型酵母菌表达载体，构建了高效表达的酵母工程菌，建立一整套酵母工程菌诱导表达、蛋白质分离纯化工艺，以获得rhtPA纯品，并对htPA的生物学特性进行了测定。

本发明在自行克隆htPA cDNA的基础上，1)对其cDNA编码序列5′端和3’端进行修饰，使其正确克隆入酵母表达载体pPIC9的α因子信号肽序列的下游，构建htPA酵母菌分泌型表达载体pPIC-9tPA；2)电穿孔法转化酵母菌GS115细胞，经筛选获得高效分泌表达htPA的基因工程酵母菌株(pPIC-9tPA/GS115)；3)发酵，分离纯化；5)生物学特性检测。

本发明的主要优点：(1)改进酵母培养基和优化培养表达条件以进一步提高表达水平。(2)表达的产物有天然的结构、正确的折叠，适度的糖基化和高的生物活性(20000IU/mg)。(3)表达产物分泌到培养基中，方便回收、纯化。

结合附图说明本发明的具体实施方法如下：

图1根据核苷酸序列推导的rhtPA氨基酸序列；

图2rhtPA纯化产物的SDS-PAGE结果；

图3rhtPA的Western blot分析；

图4酪蛋白板溶圈法测定表达产物rt-PA的活性。

实施例

1．PCR扩增htPA cDNA

设计如下引物对htPA cDNA末端进行修饰：

上游引物：5′-TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GAA GCC AGGTCT TAC-3′

下游引物：5′-TT CGC GGC CGC TCA CGG TCG CAT GTT GTC AC-3′

应用PCR方法，在htPA cDNA5′端引入酵母菌分泌信号肽序列，直接将tPA成熟肽编码区克隆入酵母α因子信号肽编码序列下游，以利于酵母菌的表达和分泌；同时利用密码子简并性原理，将htPA结构基因的第三个密码子AGA改为AGG，以利于htPA cDNA的转化和重组酵母菌的筛选。

2．pPIC-9tPA的构建