[发明专利]酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法及活性测定

权利要求书

1．酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法，包括构建工程菌、发酵、蛋白质分离纯化工艺。

2．根据权利要求1所述的酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法，其特征是将htPA cDNA5′端序列加以修饰，使htPA结构基因正确置于酵母表达载体pPIC-9的α因子信号下游，构建表达载体pPIC-9htPA，转化酵母菌GS115，经筛选建立分泌型表达htPA的酵母工程菌。

3．根据权利要求1所述的酵母菌表达人组织型纤溶酶原激活剂的生产方法，其特征是包括：

1)菌种制备

2)发酵和诱导表达：

在小量摇瓶中，以2％浓度将菌种接种于500mlBMG，即1.34％YNB,4×10^-5％生物素，1％甘油中，于30℃,250rpm/min振荡培养，至菌密度达到OD 600=4，离心弃上清，加入100ml MM培养，每天补加0.5％体积甲醇，3天后收集菌液，离心弃沉淀，电泳鉴定目的蛋白表达量及测定活性。

4．根据权利要求1所述的方法，其特征是

1)．分离酵母菌

从发酵罐收获培养液，置低温(4℃)离心机，4000转/分离心15分钟，弃沉淀，留取上清液；

2)．透析

将离心好的上清，用透析袋装好，每袋300ml，在4℃去离子水中透析24h，中间换水二次，透析完后调PH至5.8；

3)．阳离子交换层析分离纯化

将10×30cm阳离子交换层析柱CM52用0.02mol/L NaAC缓冲液PH5.8平衡，透析好的培养液缓慢上柱，4℃，每流速60ml/min,280nm检测流出液，然后用0.02mol/L NaAc,PH6.0含0.75mol/L NaCl洗脱液洗脱，收集蛋白峰检测活性，留有活性峰，产品-20℃保存；

4)．凝胶过滤层析纯化

10×120cm G25层析柱，用缓冲液(0.01mol/LPB PH7.0，含0.4mol/LNaCL)平衡柱床，流速25ml/min，阳离子交换层析纯化产品500ml上柱，流速20ml/min,280nm检测，收集蛋白峰，实验温度4℃，产品-20℃保存，检测活性，留有活性峰；

5)．阳离子交换层析分离纯化、浓缩。

5．根据权利要求1所述的方法，其特征是活性测定包括：

1)SDS-PAGE鉴定：浓缩胶5％，分离胶10％。直接取培液上清与2×上样缓冲液等体积混合后取40μl上样，作SDS-PAGE电泳，银盐染色，结果显示在60kDa左右出现一条表达条带，而空白对照无此条带。在加PMSF作为蛋白酶抑制剂的蛋白表达中，蛋白条带多，但表达的蛋白浓度相似；甲醇诱导后作SDS-PAGE，比较不同时间表达产物rt-PA条带，表明诱导后第3天条带最明显；

2)活性测定：取诱导后第3天培液上清20μl直接点在酪蛋日板上的孔内，37^oC，湿盒过夜，通过与标准t-PA的溶圈大小作对比，测定rt-PA的生物活性，结果表明rt-PA具有溶栓活性且在诱导表达后第3天为最高，其中的1株酵母菌表达rt-PA的最高活性达到2500IU/ml培液；

3)免疫原性测定：诱导后第3天的培液上清上样，10％SDS-PAGE，半干转移至硝酸维膜，以2％脱脂牛奶作封闭试剂，封闭90min后加入抗人tPA抗血清，4^oC过夜，洗涤处理，加入鼠抗兔IgG的酶标抗体。最后在DAB、H²Q²下显色，结果表明：在表达条带处出现了能被抗t-PA多抗所识别的蛋白，即表达条带具有tPA的免疫原性。