[发明专利]一种水稻分子标记方法

说明书

本发明涉及生物技术中的分子标记方法。

分子标记是一种DNA分子水平上的识别记号，用于识别特定基因和DNA片段的有无及所在位置等。现在广泛使用的分子标记方法中，与本发明较接近的方法有两种：Ⅰ．随机扩增多态性DNA(RandomAmplified Polymorphic DNA)，简称RAPD，该技术也称为随机引物PCR扩增(Arbitrary Primed PCR)，简称AP-PCR；Ⅱ．DNA扩增指纹分析(DNA Amplified Fingerprinting)，简称DAF。这两种方法的基本原理相似，均以随机引物PCR扩增为基础，即所用引物是任意的，引物的设计不需要预先知道DNA的序列，可以任意设计。两种方法的主要差别在于所用引物的长度上。RAPD使用的引物长度为10个核昔酸；DAF的引物为5～8个核苷酸。它们的共同优点是引物设计容易、操作简单、应用成本低。共同缺点是扩增结果的稳定性较差，在一些生物材料中，如水稻，扩增带的多态性(即有差异的扩增带)较低。与RAPD相比较，DAF扩增带的多态性高一些，但稳定性最差，因此现已很少使用。RAPD扩增带的多态性虽然比DAF低一些，但稳定性高一些，加之引物设计容易，操作简单、使用成本低等优点，所以至今仍是所有分子标记方法中使用得最广泛的方法。

在基于PCR扩增的分子标记方法中，引物的长度越长，所能承受的复性温度就越高，其扩增的结果也就越稳定。而上述RAPD等方法所使用的引物长度都较短，均在10个或10个核苷酸以下，需要较低的复性温度(35℃左右或更低)来维持配对，这不仅会增加非特异性扩增的机会，对温度的变化也较为敏感，因而很容易产生出不稳定的扩增产物。这就是导致上述方法结果不稳定的主要原因。因此，增加引物的长度，提高复性温度就是解决问题最简捷的方法。

本发明的目的是保留上述RAPD等方法的优点，克服其缺点，提供一种主要适合于水稻的，并又同时具有稳定可靠、操作简单、多态性高、应用成本低等优点的分子标记新方法，用于水稻的遗传图谱、基因定位及水稻的新品种选育研究。

本发明可以通过以下方式得以实现：

本分子标记方法由引物设计、引物合成、DNA提取、DNA扩增和扩增结果的电泳等步骤组成。在引物的设计中，将10个核苷酸长度的引物增加到14～18个核苷酸的长度。引物的核苷酸组成和排列顺序按照随机的方式设计，但引物中G、C碱基的含量占较高的比例，为60～80％，最佳是65～70％。设计引物时要避免如CCCC、AAAA等连续4个及以上相同碱基序列的出现。引物中最好不含有限制性内切酶的位点，如CCGG、AAGCTT等。引物设计完成后，按照设计的引物序列合成引物，合成引物后，即可进行DNA的扩增。首先提取待测样品的DNA，现已报道的DNA提取方法很多，可任意选择一种。然后在0.2ml的PCR扩增专用薄壁管中，依次加入10～40ng待测样品DNA,20ng引物，2mM MgCl₂,4种dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM及1个单位的taq聚合酶，反应总体积为25μl。除待测样品DNA和引物外，各试剂(dNTP、tap酶等)及实验用品(薄壁管、吸管、吸头等)均在专业公司购买。将加好样的薄壁管放入PCR循环仪进行扩增反应。扩增条件为：95℃下变性45秒；在45～60℃下复性60秒；72℃延伸45秒；循环30次。扩增结束后，取3μl扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上，60V下恒压电泳2小时。用银染法对凝胶进行染色，以显示扩增带。

本发明与RAPD等方法相比较，不仅提高了扩增带的稳定性和可重复性，而且提高了扩增带的多态性。并且，还保留了RAPD等方法操作简单，运行成本低的优点。

实施例：

1．引物的设计与合成：本发明最佳引物长度为16个核苷酸，其中G和C碱基占11个，A和T碱基占5个，碱基的顺序按照随机的方式排列。引物中要避免如CCCC、AAAA等连续4个及以上相同碱基序列的出现，并且最好不含有限制性内切酶的位点，如CCGG、AAGCTT等。设计好的引物由专业的DNA合成公司合成。本发明的引物由赛百盛公司合成。

2．DNA的提取本发明以水稻为材料提取DNA,DNA的提取按照卢扬江等(中国水稻科学，1992,6:47～48)报道的水稻DNA提取方法进行。