[发明专利]一种酰胺化重组多肽及其制备方法

说明书

本发明涉及一种包含至少一种编码α-酰胺化酶的核酸序列以及待酰胺化的目标多肽的核酸序列之核酸构建体，本发明进一步涉及含有所述核酸构建体的表达载体、原核宿主细胞。本发明还涉及通过利用所述核酸构建体在原核宿主中表达，制备酰胺化重组多肽，尤其是酰胺化重组降钙素的方法。

众所周知，在神经和内分泌系统产生的具有生物学活性的多肽中，大多数其C末端需要被酰胺化，而且C末端α-酰胺基对多肽的生物活性至关重要，其可能延长多肽的半衰期或增强多肽与受体的亲和力(Fuhlendorff，J.等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，87：182-186)。C端的α-酰胺基来自多肽前体的翻译后加工，由α-酰胺化酶(以下简称为α-AE，又称为肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM))催化，该反应是活性多肽生物合成过程中的限速步骤。属于这一类活性多肽的例子有降钙素、催产素、加压素、促皮质释放激素、促甲状腺释放激素、神经激肽、咽侧体抑制素、Lem-KI、红色素浓缩激素、促黄体激素释放激素、白细胞焦激肽、胃泌素、色素分散激素、皮啡肽、铃蟾肽、胃泌素释放肽、神经调节肽、胰抑制素、芋螺毒素M1、胰抑素、蜂毒肽、麻蝇毒素1A、VIP、α-MSH、MIF-1等，其C-末端的酰胺化对其生物活性至关重要。

现在已能利用重组DNA技术在原核生物中生产具有临床和商业使用价值的蛋白质和多肽，由于原核生物表达体系没有α-AE，因此不能用于生产酰胺化多肽，但可生产C-末端带有Gly的活性多肽前体。为了对这类重组活性多肽之前体进行酰胺化，目前一般采用下列方法：1)利用从天然来源的动物组织中获得的α-AE体外催化多肽前体进行酰胺化

Engels，J.W.等(核苷与核苷酸(Nucleosides & Nucleotides)6：185-195)将人生长激素释放因子前体(hGHCF-Gly)的基因在大肠杆菌中表达形成包涵体，经过一系列纯化步骤后得到hGHCF-Gly，同时从天然来源的牛垂体中分离纯化α-AE，利用纯化的α-AE催化hGHCF-Gly的体外酰胺化。由于天然来源的动物组织中α-AE含量很低，分离纯化困难，这种方法难以扩大用于活性多肽的商业化生产。2)利用基因工程方法获得的α-AE体外催化多肽前体进行酰胺化

Ray等(Bio/Technology，11：64-70)用CHO细胞分泌表达大鼠α-AE，经疏水层析和离子交换层析初步纯化后，利用纯化的α-AE催化大肠杆菌表达的鲑鱼降钙素前体(sCT-Gly)的体外酰胺化，反应的质量比(酰胺化产物的质量/酶的质量)能达到1000以上，可以用于鲑鱼降钙素的大规模生产。但是sCT-Gly和α-AE在两个不同的表达体系中分别表达，需要将所述酰胺化酶及目标多肽分别纯化后才能进行酰胺化反应，酰胺化反应完成后还需要将酰胺化的降钙素(sCT)进一步纯化，步骤繁多，工艺复杂，收率低，成本高。

李元等人在中国专利96105118.3中公开了用重组DNA技术在浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)中分泌表达鲑鱼降钙素的前体(sCT-Gly)的方法，然而该技术不能直接产生酰胺化的鲑鱼降钙素。

目前也有在真核宿主表达体系中成功制备酰胺化多肽的报道，Takahashi等(肽(Peptides)，18(3)：439-44)公开了在COS-7和CHO细胞系中表达具有生物活性的酰胺化鲑鱼降钙素的方法。由于真核表达体系存在培养成本较高，对生产条件要求严格，且从培养液中回收目标多肽困难等方面的问题，不适于大规模工业生产。

目前临床上广泛使用的生物学活性依赖于酰胺化的多肽主要有降钙素、催产素、加压素等。随着具有潜在临床和商业使用价值的其它需要酰胺化的多肽日益增多，迫切要求一种更为经济、有效的多肽酰胺化技术。为了简化工艺步骤、降低成本，本发明设计了一种核酸构建体，所述核酸构建体至少含有一种编码酰胺化酶的核酸序列和编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列。通过基因工程方法将含有该核酸构建体的表达载体转化特定原核宿主，经表达可直接获得酰胺化的、具有生物活性的目标多肽。

本发明的一个方面涉及包含至少一种编码酰胺化酶的核酸序列和编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列之核酸构建体。

本发明另一个方面涉及含有所述核酸构建体的表达载体。本发明另一个方面涉及含有所述表达载体的宿主细胞。本发明还涉及所述表达载体和宿主细胞的制备方法。

本发明又一方面涉及通过在所得适当表达宿主中表达所述核酸构建体编码的目标多肽，制备酰胺化重组多肽的方法。