[发明专利]血管粘着分子及其功能的调节

说明书

本发明涉及鉴定血管粘着分子的新亚族，以及调节这些分子的功能以治疗各种疾病。

在胚胎和出生后早期发育的整个过程中，内皮细胞通过血管生成和血管发生形成新的血管。在成年生物体内，内皮细胞限定血液组织屏障并由非循环的休眠细胞组成。这些极性化细胞彼此通过紧密接合和粘着接合连接以形成细胞的连续层。内皮细胞层的功能在于维持组织稳态、纤维蛋白溶解、凝集、血管紧张及白细胞反式迁移。所有这些性质都是受粘着分子表达和功能的精细调节控制的。

炎症、肿瘤生长、创伤或血管发生等病理状态均导致血管内皮上粘着分子数目和功能的临时改变，并进而改变血管的稳态。例如，肿瘤可增加血管生成因子的局部浓度，使非循环休眠内皮细胞转换成增殖的内皮。血管生成转换是由包括IL-8、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、可溶性VCAM-1、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肿瘤坏死因子(TNF)在内的几种因子诱导的。结果，已有血管的内皮细胞降解细胞外基质(ECM)和浸入周围组织，进而导致肿瘤的血管形成。

在血管生成转换期间，内皮细胞基因表达的模式受到改变。例如，用bFGF或TNFα处理内皮细胞可使参予内皮细胞迁移的粘着分子α_vβ3整联蛋白表达增加4倍。另外，血管生成转换可改变内皮的炎性反应，导致白细胞向肿瘤异常迁移。正常情况下，白细胞在内皮上粘着并通过内皮迁移而从血液中外渗。这些机制发生在一个涉及选择蛋白、整联蛋白和免疫球蛋白超家族粘着分子的多步骤过程中。

在肿瘤相关内皮中，已发现VCAM、ICAM和选择蛋白是受到下调的。这些粘着分子的下调可能代表一种肿瘤免受免疫系统的细胞毒性细胞侵入的机制。

本发明的目的是寻找在处于肿瘤影响下的内皮中受到转录调节的免疫球蛋白超家族(Ig Sf)的新的粘着蛋白。

本发明的再一个目的是定义用于治疗各种适应症如肿瘤和炎症的衍生于新的粘着蛋白的分子。

在导致本发明的研究中，使用小鼠实验模型鉴定在上皮细胞系与黑素瘤细胞共培养期间受调节的转录物。为了将筛选策略限制于Ig Sf的粘附分子，发展了一种称为“定向差异显示”的新的RNA显示方法。这种改良的显示技术的新颖性在于只使用一组简并引物。如将在实施例中证明的，令人惊奇地发现这种方法具有足够高的特异性。

更具体地说，使用部分简并的引物(在本案中，简并水平是一组内有2048至4096个不同形式的引物)使之针对见于Ig Sf成员的C2区域中的保守序列，以驱动基于聚合酶链反应(PCR)的定向差异显示技术(Samaridis & Colonna(1997)Eur.J.Immunol.27，660-665)。

基于这一发现，本发明提供一种特异性鉴定差异表达的DNA序列的方法，其包括使用差异显示反转录PCR，其中使用一组部分或完全简并的靶基因特异性引物。常规RNA显示策略的一个主要限制因素是该方法缺乏特异性。为了提高这种特异性，本发明人在寻找其它粘着分子中使用了针对编码带C₂区之分子的序列的简并引物。通过对比几个Ig Sf粘着分子的C₂区，并鉴定围绕参与C₂区结构：Y(RQYS)-C-x-A-S-N-x₂-G的半胱氨酸残基的线性氨基酸共有区达到了此目的。在更普遍的意义上说，这种方法也可用于寻找其它序列，其中一个或多个最常见共有序列的反向翻译被用来设计用于进行差异显示的简并引物。

该方法用于鉴定在黑素瘤或癌细胞存在下因汇合而在内皮细胞中受到下调的转录物。cDNA编码具有不寻常结构特征，并称为CRAM-1(“汇合调节的粘着分子”)的新的Ig Sf分子。目前对参予白细胞反式迁移的结构相关分子JAM的描述，提示存在有其中以JAM和CRAM-1为原型的新的粘着分子家族。与EST数据库的序列对比进一步用于此分子家族的第三个成员CRAM-2的克隆。图1显示编码CRAM-1和CRAM-2蛋白的小鼠cDNA序列。在本申请中，名称JAM和JAM-1、CRAM-1和JAM-2，以及CRAM-2和JAM-3是可以互换使用的。

编码JAM、CRAM1和CRAM-2的转录物的比较组织分布显示了这些分子在内皮和上皮区室中的优先表达，表明了其在维持细胞-细胞接触中的作用。休眠内皮细胞的细胞-细胞相互作用调节血管通透性、细胞周期及白细胞穿过内皮细胞壁的反式迁移。