本发明公开了磷脂酶D‑PKV‑S109L及其应用,属于酶的基因工程技术领域。所述磷脂酶D‑PKV‑S109L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述磷脂酶D‑PKV‑S109L在制备磷脂酰肌醇中的应用。本发明还公开了一种制备磷脂酰肌醇的方法:以磷脂和肌醇为底物,在磷脂酶D‑PKV‑S109L的作用下,生成磷脂酰肌醇。本发明通过改变DNA序列中的碱基来实现某些氨基酸的替换,从而获得了底物特异性更强的磷脂酶D‑PKV‑S109L,可用于高效制备磷脂酰肌醇。本发明的制备磷脂酰肌醇的方法,磷脂酰肌醇的产率可达57.04%,相比于磷脂酶D‑PKV,产率提升了22.64%。