本发明涉及基因工程重组型褐藻胶裂解酶在制备系列寡糖产物中的应用。M‑专一性褐藻胶裂解酶在降解底物生成系列不饱和寡糖产物中的应用；所述重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者，所述重组褐藻胶裂解酶为褐藻胶裂解酶Avi‑rEAlgL褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL和Avi‑rEAlgL是M专一性的内切型褐藻胶裂解酶，是一种高效的制备富G段寡糖的工具酶。褐藻胶裂解酶Pae‑rEAlgL和Avi‑rEAlgL具有适冷特性和广泛的pH稳定性，有望成为用于治疗囊性纤维病的酶制剂。
本发明公开了一种褐藻胶裂解酶AlgFP及其制备方法和应用，其中褐藻胶裂解酶AlgFP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；其制备方法为将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶基因全合成后，构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导培养并获得分泌表达的褐藻胶裂解酶；该褐藻胶裂解酶可单独用于褐藻酸及其盐类的降解制备褐藻酸寡糖；或者所述褐藻胶裂解酶与其他褐藻胶裂解酶混合使用，协同降解褐藻酸及其盐类本发明获得的褐藻胶裂解酶对褐藻酸钠底物有较高的水解活性，摇瓶发酵产生的粗酶液即具有0.53ml(蛋白质含量约0.015mg)彻底降解1g褐藻酸钠的能力，具有良好的工业应用前景。
本发明公开了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码该褐藻胶裂解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或海藻酸钠中的应用，在制备褐藻寡糖中的应用。本法发明还公开了一种制备褐藻寡糖的方法：采用褐藻胶裂解酶降解褐藻胶制备褐藻寡糖，最适反应pH为9.0，最适反应温度为60℃，反应时间2 h，所得褐藻寡糖的聚合度为2～4。本发明的褐藻胶裂解酶，可以在温和的条件下裂解褐藻胶或海藻酸钠，酶活性高，且具有较好的温度稳定性，相较于已报道的褐藻胶裂解酶，可在底物溶解性较好的高温下进行反应，可高效降解褐藻胶制备褐藻寡糖。
本发明涉及一种具有热恢复特性的褐藻胶裂解酶及其应用。所述褐藻胶裂解酶为一种褐藻胶裂解酶AlyL05，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的褐藻胶裂解酶氨基酸序列与现有已知功能的褐藻胶裂解酶序列相似度仅为49%。本发明所述的褐藻胶裂解酶AlyL05具有热恢复特性，在煮沸5分钟后，放置在冰上孵育30分钟，可恢复其58.3%的活性。该酶降解主产物为不饱和褐藻胶二、三糖。本发明所述的褐藻胶裂解酶性质稳定，产量大，具有一定的工业化应用潜质。
本发明公开了一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶的第212位谷氨酸替换为组氨酸和/或第222位精氨酸替换为赖氨酸。本发明通过分子对接模拟确定褐藻胶裂解酶活性中心氨基酸并进行定点饱和突变改变蛋白质分子活性位点附近氨基酸残基，提高褐藻胶裂解酶催化效率，进一步提高褐藻胶裂解酶产量。本发明构建的褐藻胶裂解酶分泌能力增强的重组大肠杆菌可将褐藻胶裂解酶酶活较出发菌株提高2.83倍。改造后的基因工程菌产酶能力显著提高，摇瓶发酵生产褐藻胶裂解酶酶活达到15000U/mL，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
本发明提供了一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用，所述褐藻胶裂解酶具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过1‑20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有褐藻胶裂解酶的活性。本发明中，将褐藻胶裂解酶全基因进行截短，降低分子量，显著提高了宿主细胞对褐藻胶裂解酶的表达量，分泌的褐藻胶裂解酶活性高、稳定性好、对褐藻酸钠的降解能力强。
本发明公开了一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用，褐藻胶裂解酶基因的核酸序列如SEQ ID N0:1；所述核苷酸序列编码的褐藻胶裂解酶Alg3，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2。本发明还公开利用基因工程的技术方法，转化褐藻胶裂解酶基因的基因工程菌株为大肠杆菌，通过将所述褐藻胶裂解酶基因与载体连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌来制备的褐藻胶裂解酶。所述褐藻胶裂解酶能够专一性降解海藻酸钠生产褐藻寡糖，并且可以与纤维素酶共同使用水解海带，产生水溶性寡糖产物，因此可以用于褐藻寡糖的制备，且反应条件温和，能源消耗少，无污染物产生，具有重要的工业应用价。
本发明涉及一种具有热恢复特性的内切型褐藻胶裂解酶及其应用。所述褐藻胶裂解酶为一种新型褐藻胶裂解酶AlyV11，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的褐藻胶裂解酶N端含有一段铰链区（Met1‑Thr12），其氨基酸序列与已知功能的褐藻胶裂解酶序列相似度仅为79%。本发明所述的褐藻胶裂解酶AlyV11具有热恢复特性，在煮沸5分钟后，放置在30℃孵育10分钟，可恢复其61.5%的活性。该酶作用方式为内切，降解主产物为不饱和褐藻胶二、三糖。本发明所述的褐藻胶裂解酶产量大，性质新颖，具有一定的工业化应用潜质。
