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[发明专利]一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用-CN202211494841.3在审
发明人：蔡文博;智庆文 -专利权人：江苏晨逸京泽生物科技有限公司
申请日： 2022-11-26 - 公布日： 2023-03-07 - 主分类号： C12Q1/686 文献下载
摘要：本发明公开了一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，属于PCR技术领域，一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，包括配制mix、设计引物、建立体系，扩增PCR、验证产物、回收产物、连接转化、阳性筛选、菌液测序，可以实现通过高突变率的易错PCR技术对基因文库的构建、快速获得优质基因、对特定基因进行定向进化，通过配制易错PCR反应mix，在针对不同的基因设计引物，且片段大小不同，随后建立易错PCR反应体系，将配制好的易错PCR反应体系放入PCR扩增仪中进行易错PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳验证易错PCR产物，在胶回收得到纯化的易错PCR产物，从而进行连接、转化，阳性克隆筛选，菌液送测序，不仅操作简便，同时得到的PCR产物产量高、变异水平高。
一种突变 pcr 技术建立应用

[发明专利]一种利用不同程度的连续易错PCR进行定向进化的方法-CN200910048020.5无效
发明人：孟清;周倩 -专利权人：东华大学
申请日： 2009-03-23 - 公布日： 2009-08-19 - 主分类号： C12P19/34 文献下载
摘要：本发明涉及一种利用不同程度的连续易错PCR进行定向进化的方法，包括：选择目的基因为模板设计引物；配制高、中、低不同程度的d[X]TP易错PCR体系；将配制好的PCR反应体系放入PCR仪中进行PCR扩增；将易错PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳回收，进行酶切、与载体连接、转化，进行阳性克隆筛选，提取质粒；以提取的质粒为模板，进行第二轮易错PCR；利用相应筛选系统进行有用突变的筛选。
一种利用不同程度连续 pcr 进行定向进化方法

[发明专利]易错PCR/卡那霉素筛选系统定向进化蛋白质内含子-CN201110053243.8无效
发明人：李曼;孟清 -专利权人：东华大学
申请日： 2011-03-04 - 公布日： 2011-10-05 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：本发明涉及一种易错PCR/卡那霉素筛选系统定向进化蛋白质内含子的方法，包括：1)制备大量用于定向进化的载体；2)对蛋白质内含子进行易错PCR，然后与上述用于定向进化的载体连接并灭活，再经过浓缩转化感受态细胞，涂含有氨苄霉素和卡那霉素的双抗平板；3)对在上述双抗平板上生长的菌落进行菌液PCR验证，并以初步鉴定为阳性克隆获得其混合质粒作为下一轮易错PCR的模板，进行多轮易错PCR，即得。本发明能较灵敏地筛选剪接活性提高的蛋白质内含子，通过调整PCR体系各成分的配比，扩增出来大量的DNA片段，该方法获得的蛋白质内含子剪接活性高。
易错 pcr 卡那霉素筛选系统定向进化蛋白质内含

[发明专利]一种通过易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活方法-CN202110942269.1在审
发明人：祁飞;刘瑞敏;张真真 -专利权人：安徽金禾实业股份有限公司
申请日： 2021-08-17 - 公布日： 2021-11-02 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：本发明提供一种易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活的方法，包括以下步骤：a.EUGT11易错PCR扩增;b.易错PCR突变体库构建;c.高通量筛选酶活提高突变菌株；d.高酶活突变菌株序列分析
一种通过 pcr 技术通量筛选提高葡萄糖基转移酶 eugt11 方法

[发明专利]赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法-CN201710312817.6在审
发明人：陆文强;周豪宏;刘修才 -专利权人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司;凯赛生物产业有限公司
申请日： 2017-05-05 - 公布日： 2018-11-13 - 主分类号： C40B50/06 文献下载
摘要：本发明涉及生物酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法，具体涉及适用于长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的易错PCR定向进化突变体文库的构建方法及高或低活力突变株高通量筛选的方法。本发明采用易错PCR分段突变、PCR整合、DpnI酶消化、系列pH指示剂指示pH变化的方法，解决了常规易错PCR方法无法有效构建长片段基因突变体文库、连接效率低、pH变化超过指示剂指示范围的难题，为从赖氨酸脱羧酶的突变体文库中筛选出酶活提高或降低的突变株提供了快速
突变体文库突变株赖氨酸脱羧酶高通量筛选易错PCR 低活力构建基因突变体指示剂指示定向进化连接效率有效构建基因长片段生物酶酶活整合文库分段突变筛选消化

[发明专利]一种高通量鉴定产生1-脱氧野尻霉素菌株的方法-CN201410608507.5有效
发明人：唐双焱;蒋培霞;穆姗姗 -专利权人：中国科学院微生物研究所
申请日： 2014-11-03 - 公布日： 2019-06-11 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明提供的方法，包括如下步骤：1)构建表达DNJ生物合成途径的重组载体和表达β‑半乳糖苷酶的出发菌；2)得到相应DNJ合成基因的易错PCR产物；3)以所述相应DNJ合成基因的易错PCR产物为引物，所述重组载体为模板，进行MEGAWHOP PCR，得到MEGAWHOP PCR质粒突变体库；4)将所述MEGAWHOP PCR质粒突变体库转入所述出发菌中，涂平板，得到突变库平板；从所述突变库平板上选取颜色比所述野生菌平板上菌落颜色浅的菌落
一种通量筛选产生脱氧霉素菌株方法

[发明专利]一种蛋白质定向进化的方法-CN202310652836.9在审
发明人：方柏山;林建文;黄世阳 -专利权人：厦门大学
申请日： 2023-06-02 - 公布日： 2023-10-24 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：所述筛选质粒的结构为luxpR启动子1‑核糖体结合位点‑luxR‑终止子‑luxpR蛋白基因‑核糖体结合位点‑细菌裂解蛋白基因lysis‑终止子‑luxpR启动子2‑核糖体结合位点‑目的蛋白基因‑终止子；2)采用易错PCR扩增目的蛋白基因得易错PCR产物；3)通过酶连反应将筛选质粒和易错PCR的产物连接，构建重组质粒；4)将重组质粒转化感受态细胞，涂布至含有目的蛋白基因的底物和抗生素的平板上，培养一段时间，筛选出含目的蛋白基因的突变株
一种蛋白质定向进化方法

[发明专利]谷氨酰胺合酶突变体及其应用-CN202111530525.2有效
发明人：栾明月;吴涛;姚嘉琪;赵津津;李岩 -专利权人：廊坊梅花生物技术开发有限公司
申请日： 2021-12-14 - 公布日： 2023-06-06 - 主分类号： C12N9/00 文献下载
摘要：本发明通过易错PCR方法强化异源谷氨酰胺合酶，促进谷氨酰胺或者谷氨酰胺衍生物的生产。具体地，通过对不同来源的谷氨酰胺合酶编码基因进行密码子优化，然后通过易错PCR的方法构建突变体文库，获得谷氨酰胺合酶突变体。
谷氨酰胺突变体及其应用

[发明专利]利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法-CN202211493335.2在审
发明人：冯建敏;韩典霖;杨亮 -专利权人：济凡生物科技（北京）有限公司
申请日： 2022-11-25 - 公布日： 2023-06-06 - 主分类号： C12N9/12 文献下载
摘要：本发明涉及突变体的筛选方法技术领域，尤其为利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法，首先对Taq酶原始序列的确定，根据氨基酸序列进行基因合成，将目的片段构建入pET30a载体中，接着采用易错PCR对目的基因的核苷酸进行突变，并构建突变体表达文库，采用易错PCR对目的基因的核苷酸进行突变，取突变体库菌种1ml转接入50ml的LB培养基中，37℃在摇床上进行160rpm振荡培养，待菌液OD600达到0.5左右时，降温至30℃，本发明不需要进行荧光探针法检测，只需要采用常规的PCR条件即可，对设备要求低，较易实现，同时，此发明在筛选时不需要靶向到特定的单细胞，主要通过优势积累，只对最终的产物进行提取分析
利用 pcr 富集扩增抗逆性 dna 聚合通量筛选方法

[发明专利]酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用-CN201610528933.7在审
发明人：肖志壮;张稳 -专利权人：青岛红樱桃生物技术有限公司
申请日： 2016-07-06 - 公布日： 2016-11-16 - 主分类号： C12N9/04 文献下载
摘要：本发明以根据巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性进行过优化的葡萄糖氧化酶为基础，使用易错PCR 方法对该酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法挑选出正突变，经过两轮易错PCR和之后的理性设计，最终获得4个酶活显著提高的突变体，分别为GOD‑M01、GOD‑M02、GOD‑M03和GOD‑M04，其酶活与原始基因相比，分别提高了47%、55%、83%和117%。
活性提高葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体应用

[发明专利]酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用-CN201810578897.4有效
发明人：肖志壮;张稳;薛海曌;方安然 -专利权人：青岛红樱桃生物技术有限公司
申请日： 2018-06-07 - 公布日： 2021-01-26 - 主分类号： C12N9/42 文献下载
摘要：本发明通过对原始基因来源于黑曲霉的β‑甘露聚糖酶突变体使用易错PCR方法对β‑甘露聚糖酶糖酶MAN‑1基因进行进一步改造，再使用高通量筛选方法挑选出正突变，经过一轮易错PCR，最终获得4个酶活显著提高的新的突变体
活性耐热性提高甘露聚糖突变体及其编码基因应用

[发明专利]一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法-CN201810905470.0在审
发明人：吴黎诚;郭小雷;章权 -专利权人：浙江正硕生物科技有限公司
申请日： 2018-08-10 - 公布日： 2018-12-28 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：Proteus mirabilis)L‑氨基酸脱氨酶（L‑amino acid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1），构建质粒LAAD，转化构建重组菌PMLAAD；2.易错PCR；3.突变文库的建立；4.发酵；5.酶催化反应及显色；6.酶标仪检测；7.筛选突变子发酵和筛选；8.突变株发酵和筛选。通过高通量筛选系统结合易错PCR，大大节约了时间和成本，并提高了筛选效率，提高了获得正突变菌株的几率。
脱氨酶筛选突变发酵高通量筛选重组菌株易错PCR 重组菌氨基酸构建高通量筛选系统基因工程技术奇异变形杆菌酶催化反应全基因合成正突变菌株构建质粒突变文库酶标仪突变株显色基因检测节约转化

[发明专利]酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用-CN201710508365.9有效
发明人：肖志壮;崔巍;张稳;薛海曌;方安然 -专利权人：青岛红樱桃生物技术有限公司
申请日： 2017-06-28 - 公布日： 2019-11-26 - 主分类号： C12N9/24 文献下载
摘要：本发明以能够在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris中进行高效表达的β‑甘露聚糖酶为基础，使用易错PCR方法对该酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法挑选出正突变，经过两轮易错PCR，
甘露聚糖酶酶活易错PCR 酶活性突变体突变巴斯德毕赤酵母高通量筛选编码基因高效表达酶基因应用

[发明专利]提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体及其编码基因和应用-CN202110066370.5有效
发明人：肖志壮;方安然;孙建飞;于文君;付五兵;王金龙 -专利权人：青岛尚德生物技术有限公司
申请日： 2021-01-19 - 公布日： 2021-08-17 - 主分类号： C12N9/56 文献下载
摘要：本发明通过使用易错PCR方法对Bacillus licheniformis来源的蛋白酶基因进行改造，再通过筛选得到单点突变的蛋白酶突变体APR01，并在此基础上，利用第二轮易错PCR，筛选获得了两个含有两个点突变的蛋白酶突变体APR02和APR03，以及一个含有三个点突变的蛋白酶突变体APR04。
提高降解蛋白能力蛋白酶突变体及其编码基因应用

[发明专利]一种耐高温的脂肪酶-CN201110259295.0无效
发明人：刘刚;方井霞;张柏松;苏东风 -专利权人：刘刚
申请日： 2011-09-05 - 公布日： 2012-06-06 - 主分类号： C12N9/20 文献下载
摘要：本发明公开了一种经过改造可以在高温条件下具有降解油脂能力脂肪酶的核苷酸序列和氨基酸序列，本发明的技术方案要点为首先合成变形斑沙雷菌脂肪酶基因，将其与质粒相连，然后设计引物进行易错PCR扩增，纯化易错PCR
一种耐高温脂肪酶

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