提供用于抗斑萎病烟草育种背景筛选的PCR引物组合,包括第一PCR引物组、第二PCR引物组、第三PCR引物组、第四PCR引物组和/或第五PCR引物组;第一PCR引物组由SEQ ID NO:1‑3所示的三条引物组成;第二PCR引物组由SEQ ID NO:4‑6所示的三条引物组成;第三PCR引物组由SEQ ID NO:7‑9所示的三条引物组成;第四PCR引物组由SEQ ID NO:10‑12所示的三条引物组成;第五PCR引物组由SEQ ID NO:13‑15所示的三条引物组成;所述抗斑萎病烟草为供体亲本Polalta烟草和受体亲本K326烟草的杂交及回交后代。