本发明涉及纳豆激酶重组表达载体、重组基因工程菌及应用,属于基因工程技术领域。在所述的载体的启动子之前串联有1个如SEQ ID NO.1所示的启动子,所述重组表达载体的信号肽为SEQ ID NO.15对应的核苷酸。本发明还提供含上述重组表达载体的重组基因工程菌,所述为枯草芽孢杆菌WB800。本发明还提供所述重组表达载体和重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。重组表达载体和重组基因工程菌中的纳豆激酶基因来源于纳豆芽孢杆菌Bacillus natto N2,较原始启动子和信号肽,本发明纳豆激酶的表达量从22.3FU/mL增加至247.1FU/mL。