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[发明专利]外源基因定点整合的双重荧光筛选方法-CN00116072.9无效
发明人：汪亚平;胡炜;陈尚萍;朱作言 -专利权人：中国科学院水生生物研究所
申请日： 2000-10-11 - 公布日： 2002-05-08 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：本发明公开了一种外源基因定点整合的双重荧光筛选方法,该方法以受体基因组靶位DNA顺序为定点整合载体的同源DNA片段,以绿色荧光蛋白GFP基因为正向选择基因,置于同源DNA片段内,以蓝色荧光蛋白BFP基因为负向选择基因,置于同源DNA片段,构建双重荧光筛选定点整合载体。本发明方法易行,操作简便,在转基因细胞中进行荧光筛选获得定点转基因细胞,在转基因胚胎中直接筛选定点整全的转基因动物嵌合体,不需要胚胎干细胞和胚胎嵌合体操作。
基因定点整合双重荧光筛选方法

[发明专利]定点突变ApoE基因与LDLR基因的方法-CN201610756699.3有效
发明人：牟玉莲;李奎;黄雷;程英;徐奎 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2016-08-29 - 公布日： 2019-10-25 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明公开了定点突变ApoE基因与LDLR基因的方法。本发明公开的定点突变ApoE基因与LDLR基因的方法，包括向受体动物细胞中导入靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因、靶向LDLR基因靶序列的gRNA的编码基因与Cas9的编码基因，得到ApoE基因与LDLR基因被定点突变的动物细胞；实验证明，本发明的靶向ApoE基因靶序列的gRNA和靶向LDLR基因靶序列的gRNA能分别高效识别ApoE基因与LDLR基因，在它们的作用下，APOE和LDLR基因的平均双等位基因编辑效率可达31％，表明本发明的方法可以用来定点突变ApoE基因与LDLR基因。
定点突变 apoe 基因 ldlr 方法

[发明专利]rep基因表达质粒，P5NIE顺式元件定点整合体系及其制备方法和应用-CN200510112285.9无效
发明人：冯登敏;朱焕章;陈金中;贾韦国;薛京伦 -专利权人：复旦大学
申请日： 2005-12-29 - 公布日： 2006-07-26 - 主分类号： C12N15/11 文献下载
摘要：本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体为一种Rep基因表达质粒，P5NIE顺式元件定点整合体系及其制备方法和在基因治疗中的应用。该定点整合体系由携带有P5NIE顺式元件及EGFP报告基因的表达质粒与rep基因表达质粒共同作用构成。该定点整合体系可用于人类细胞株定点导入外源基因，制备程序简单，P5NIE顺式元件与其它报告基因联合适用可以达到使外源基因定点整合、长期表达的目的，便于得到稳定整合的携带转基因的细胞株。与其他治疗基因联合运用，可以适用于多种疾病的基因治疗。
rep 基因表达质粒 p5nie 顺式元件定点整合体系及其制备方法应用

[发明专利]一种基因定点突变的方法-CN201911212017.2在审
发明人：王万林;刘秀红;肖娟;陈华波;翟立红;赵宝明;沈小芳 -专利权人：湖北文理学院
申请日： 2019-11-29 - 公布日： 2020-03-20 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：本发明公开一种基因定点突变的方法，所述基因定点突变的方法包括以下步骤：以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。本发明通过先对目标基因片段进行重叠延伸PCR扩增，以对目标基因片段进行定点突变，得到含有突变位点的基因片段，然后将该含有突变位点的基因片段与连入合适的载体，即可获得重组质粒，作为重叠延伸PCR法的扩展，避免了以重叠延伸PCR法直接对长基因进行全长基因扩增时，难以获得含有突变位点的扩增产物的问题，提供了一种适用于长基因定点突变的有效方法。
一种基因定点突变方法

[发明专利]一种创建有限生长株型棉花的方法-CN201811634375.8有效
发明人：陈伟;张永山;姚金波;李燕;房圣涛 -专利权人：中国农业科学院棉花研究所
申请日： 2018-12-29 - 公布日： 2021-11-23 - 主分类号： C12N15/29 文献下载
摘要：本发明提供了一种通过基因定点编辑技术快速创建主茎和果枝表现有限生长的棉花材料的方法。本发明的方法针对株型调控候选基因GhLSGZ，利用一种基因定点编辑技术将GhLSGZ敲除，获得有限生长习性的Ghlsgz突变体，该突变体可以用于改良棉花株型，获得株型优良的棉花新品系。本发明获得的Ghlsgz突变体可通过后代分离，将转基因元件排除。本发明还提供了GhLSGZ基因的定点敲除突变基因、用于敲除GhLSGZ基因功能的靶点序列及其互补引物、用于敲除GhLSGZ基因的定点敲除载体、定点敲除零式果枝基因GhLSGZ基因的方法、以及调控棉花株型和成熟期的方法
一种创建有限生长株型棉花方法

[发明专利]定点突变ApoE基因的方法-CN201610755598.4有效
发明人：牟玉莲;李奎;黄雷;程英;徐奎 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2016-08-29 - 公布日： 2019-09-13 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明公开了定点突变ApoE基因的方法。本发明公开的定点突变ApoE基因的方法，包括向受体动物细胞中导入靶向ApoE基因靶序列的gRNA的编码基因与Cas9的编码基因，得到ApoE基因被定点突变的动物细胞；ApoE基因靶序列为序列表中序列1的核苷酸序列；靶向ApoE基因靶序列的gRNA的序列为将序列表中序列2中的T替换为U得到的序列。实验证明，本发明的靶向ApoE基因靶序列的gRNA能高效识别ApoE基因，对ApoE基因平均编辑效率达86％，表明本发明的方法可以用来定点突变ApoE基因。
定点突变 apoe 基因方法

[发明专利]一种拟南芥的定点整合转基因方法-CN201010201800.1无效
发明人：孙小芹;杭悦宇 -专利权人：江苏省中国科学院植物研究所
申请日： 2010-06-17 - 公布日： 2010-11-24 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了一种拟南芥的定点整合转基因方法，通过花期喷雾法，利用农杆菌将靶位点整合到目的植株的基因组中，筛选出单拷贝杂合体转基因植株后，再一次通过花期喷雾法，利用农杆菌将目的基因整合到筛选出的单拷贝杂合体转基因植株的基因组中，筛选出定点整合纯合体植株，即为成功定点整合植株。对拟南芥采用该定点整合转基因方法，转化率高，且周期短。
一种拟南芥定点整合转基因方法

[发明专利]一种利用修饰的ssODN提高细胞基因组定点修饰效率的方法-CN201910782035.8有效
发明人：吴珍芳;李国玲;张献伟;王豪强;李紫聪;蔡更元;刘德武;杨化强 -专利权人：华南农业大学
申请日： 2019-08-23 - 公布日： 2021-10-15 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明公开了一种利用修饰的ssODN提高细胞基因组定点修饰效率的方法。该方法通过CRISPR/Cas9系统与经修饰后的ssODN共同作用于细胞来实现。具体地为，CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处ssODN与目的基因碱基互补配对，高效的完成基因组定点修饰，而经修饰后的ssODN可以显著提高定点修饰的效率。
一种利用修饰 ssodn 提高细胞基因组定点效率方法

[发明专利]一种山羊BLG基因定点敲除修饰系统及应用-CN201610176047.2在审
发明人：成勇;宋绍征;朱孟敏 -专利权人：扬州大学
申请日： 2016-03-25 - 公布日： 2016-07-06 - 主分类号： C12N9/22 文献下载
摘要：本发明属于基因工程技术领域，涉及一种山羊BLG基因定点敲除修饰系统及应用。所述定点敲除修饰系统为剪切山羊BLG基因靶序列的转录激活样效应因子核酸酶TALENs；本发明是利用该系统定点敲除山羊BLG基因和敲入人乳铁蛋白(hLF)基因，获得BLG^‑/hLF⁺转基因胎儿成纤维细胞，并应用该细胞作为供核细胞，通过体细胞核移植制备BLG^‑/hLF⁺基因打靶转基因山羊。为定点修饰的转基因哺乳动物制备建立了更为便捷、可靠和经济的技术体系。
一种山羊 blg 基因定点修饰系统应用

[发明专利]一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法-CN201711477805.5有效
发明人：吴珍芳;张献伟;李国玲;杨化强;莫健新;钟翠丽;石俊松;贺晓燕;张健;李紫聪;蔡更元 -专利权人：温氏食品集团股份有限公司;华南农业大学
申请日： 2017-12-29 - 公布日： 2021-07-09 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，包括以下步骤：S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证；S2、构建同源臂供体质粒，并获得定点整合转基因细胞系；S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建本发明在供体质粒中引入gRNA靶点序列，利用细胞内转录gRNA诱导Cas9核酸酶切割靶基因同时，线性化供体质粒，大大简化试验步骤，节约人力，且有利于提高共转染效率。本发明定点整合所用载体较少，同源臂大小适中，更有利于获得转基因细胞系，将高效定点整合技术，高活力定点转基因细胞培育技术与体细胞克隆技术结合，有利于定点整合转基因动物高效制备，加快转基因动物新品种培育速度
一种定点整合 dna 转基因构建方法

[发明专利]一种利用小分子化合物提高基因组定点修饰效率的方法-CN201910782039.6有效
发明人：吴珍芳;李国玲;张献伟;王豪强;李紫聪;蔡更元;刘德武;杨化强 -专利权人：华南农业大学
申请日： 2019-08-23 - 公布日： 2021-10-12 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本公开涉及基因工程技术领域，特别涉及一种利用小分子化合物提高基因组定点修饰效率的方法。该方法通过CRISPR/Cas9系统与小分子化合物共同作用于细胞来实现。具体地为，CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，小分子化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点修饰，经小分子化合物处理的细胞基因组定点修饰效率显著提高
一种利用分子化合物提高基因组定点修饰效率方法

[发明专利]定点突变LDLR基因的方法-CN201610753031.3有效
发明人：牟玉莲;李奎;黄雷;程英;徐奎 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2016-08-29 - 公布日： 2019-09-13 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了定点突变LDLR基因的方法。本发明公开的定点突变LDLR基因的方法，包括向受体动物细胞中导入靶向LDLR基因靶序列的gRNA的编码基因与Cas9的编码基因，得到LDLR基因被定点突变的动物细胞；LDLR基因靶序列为序列表中序列3的核苷酸序列或序列表中序列4的核苷酸序列；靶向LDLR基因靶序列的gRNA的序列为将序列表中序列5或序列6中的T替换为U得到的序列。实验证明，本发明的靶向LDLR基因靶序列的gRNA能高效识别猪LDLR基因，在其作用下LDLR基因平均编辑效率可达50％，表明本发明的方法可以用来定点突变LDLR基因。
定点突变基因基因靶序列靶向核苷酸序列编码基因动物细胞高效识别受体动物替换细胞

[发明专利]一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法-CN201410553171.7在审
发明人：陈勇龙;黄华荣;张遵义;羊雪芹 -专利权人：杭州师范大学
申请日： 2014-10-17 - 公布日： 2015-02-11 - 主分类号： C12N15/89 文献下载
摘要：本发明公开了一种将外源基因定点整合到哺乳类动物靶标基因的方法，利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合到靶标基因，特别是将Cre基因定点整合到小鼠Enpp1基因第一个外显子内，该技术不仅整合效率高(20％)；操作步骤简单，仅需构建一个外源基因载体；同时不存在位置效应影响。
一种将外源基因定点整合靶标方法

[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用-CN201510854747.8有效
发明人：夏兰琴;孙永伟;赵云德;马有志;吴传银;张欣 -专利权人：中国农业科学院作物科学研究所
申请日： 2015-11-30 - 公布日： 2019-10-25 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用。本发明的用于植物基因组定点修饰的系统，含有用于植物基因组定点修饰的载体和供体DNA；所述用于植物基因组定点修饰的载体含有Cas9蛋白表达盒、gRNA表达盒和供体DNA；所述gRNA表达盒编码两种gRNA，所述两种gRNA分别靶向于目的植物的靶DNA的两个靶位点；所述靶DNA中待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间。利用本发明的系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的技术体系，无脱靶效应，为在水稻和其它作物中利用此系统进行基因的定点修饰提供了依据，为改良其它重要农作物的农艺性状提供基础。
修饰植物基因组抗除草剂水稻供体DNA 靶位点表达盒靶DNA 蛋白表达盒重要农作物技术体系目的植物农艺性状此系统靶向应用改良基因

[发明专利]一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法-CN201910782047.0有效
发明人：张献伟;王豪强;李国玲;刘德武;黄广燕;李紫聪;蔡更元;吴珍芳;杨化强 -专利权人：温氏食品集团股份有限公司
申请日： 2019-08-23 - 公布日： 2021-10-01 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法。该方法通过小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共同作用于细胞来实现。具体地为，是在CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，小分子化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点插入，经小分子化合物处理的细胞基因组定点插入效率显著提高
一种利用分子化合物提高基因组定点插入效率方法

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