本发明属于食品安全检测技术领域,具体涉及一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组、试剂盒和检测方法。本发明提供了一组同时鉴定3类剧毒蘑菇的多重引物组,其序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.9所示,将其合并一管作为多重引物组,可用于制备同时鉴定3类剧毒蘑菇的试剂盒。利用本发明所述多重引物组或试剂盒,可在同一反应管同时进行荧光PCR扩增,实现3大类12种剧毒蘑菇的同时检测鉴定,极大地提高了检测效率,降低了检测成本。本发明提供的多重实时荧光PCR试剂盒操作简便快捷,具有检测特异性强、灵敏度高等优点,适用于蘑菇及加工品等样品,可为食源性蘑菇中毒应急处置提供技术支撑。