[发明专利]一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用在审
| 申请号： | 201910586863.4 | 申请日： | 2019-07-02 |
| 公开（公告）号： | CN110408640A | 公开（公告）日： | 2019-11-05 |
| 发明（设计）人： | 张万江;邵萌;张舜文;吴芳;吴江东;张杰;董江涛;张辉;徐芳;柳小玲;朱荟云;梁粟 | 申请（专利权）人： | 石河子大学 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N1/21;C12Q1/18;C12R1/32 |
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| 地址： | 832002 新疆维*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法及应用。基于融合PCR技术以及T载体克隆技术，首次构建并鉴定PhoP/PhoR基因的置换型缺失突变载体T‑PhoPR，利用电转化技术使得重组的PhoP/PhoR基因缺失突变载体进入结核分枝杆菌感受态细胞，通过染色体同源重组以及多重筛选、鉴定，首次获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。本发明构建的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，同时敲除了参与调控MTB感受宿主微环境变化的PhoP基因和PhoR基因，可降低MTB的耐药性，使其对抗结核药物恢复敏感性，为探索MTB PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制提供一定的帮助，为进一步寻找新的抗结核药物作用靶点奠定基础提供依据。 | ||
| 搜索关键词： | 基因缺失 结核杆菌 突变菌株 构建 结核分枝杆菌 耐药性 基因 卡那霉素抗性基因 染色体同源重组 宿主 感受态细胞 抗结核药物 双组分系统 调控机制 结核药物 缺失突变 突变载体 作用靶点 电转化 微环境 置换型 应用 克隆 筛选 融合 调控 对抗 恢复 探索 帮助 | ||
【主权项】：
1.一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、结核分枝杆菌 PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体的构建及鉴定方法通过SOE‑PCR技术、琼脂糖凝胶回收试剂盒及琼脂糖凝胶电泳法纯化、构建并鉴定结核分枝杆菌缺失突变片段PhoPR‑K，通过T载体克隆技术及基因测序技术将构建鉴定成功的结核分杆菌PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体命名为T‑PhoPR，并利用质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，用DNA凝胶电泳鉴定，同时用紫外分光光度计测定质粒的浓度及纯度；步骤2、结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及筛选方法通过电转化技术使得10μl T‑PhoPR进入100μl新鲜制备的MTB感受态细胞，同时取110μl不加任何质粒的结核分枝杆菌感受态细胞作为空白对照，利用染色体同源重组以及多重筛选、鉴定获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。
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- 2018-12-28 - 2019-05-03 - C12N15/74
- 本发明属于生物技术领域，具体公开了一种重组乳酸乳球菌及其构建方法和应用。本发明构建的一种重组乳酸乳球菌能够表达人内皮抑素且重组乳酸质粒能稳定遗传。根据本发明所构建的重组乳酸乳球菌，能够应用于制备抗肿瘤药物或食品中，包括：抑制肿瘤的生长、延长荷瘤模型生存期、促进肿瘤大面积坏死、抗肿瘤转移的药物或食品中的应用。
- 一种利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法-201811595939.1
- 刘胜;蒙亮;刘欣;王鹏;顿先才;徐国华;申婵;胡艳红 - 华中科技大学鄂州工业技术研究院;华中科技大学
- 2018-12-25 - 2019-04-26 - C12N15/74
- 本发明提供了一种利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法，步骤包括：S1、将隐地蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中；S2、将步骤S1所得质粒转入短短芽孢杆菌宿主中；S3、发酵培养步骤S2所得短短芽孢杆菌，所述发酵培养的培养条件为：T2培养基、温度30～33℃、转速120～200rpm、发酵培养时间24～60h；S4、收集发酵后的菌液，分离提取隐地蛋白液；所述分离提取方法包括：离心菌液收集上清，对上清液进行切向流超滤获得滤液、超滤浓缩滤液即得隐地蛋白液。该方法能够简便快速的获取高纯度的隐地蛋白，且所得的隐地蛋白溶液直接用作农用抗菌抑菌剂能够达到明显促进植物生长的效果，具备良好的应用前景。
- 用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒及相应的基因靶向点突变方法-201811622618.6
- 刘永生;敬文宪;李学瑞;周建华;马丽娜;陈启伟 - 中国农业科学院兰州兽医研究所
- 2018-12-28 - 2019-04-19 - C12N15/74
- 本发明提供用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒，所述重组质粒含有Kan抗性基因与sacB基因片段。本发明还提供应用该重组质粒进行鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的方法。本发明结合red同源重组系统和自杀性质粒构建系统这两种方法的优点，成功构建了同时具备以上两种功能的重组质粒，同时本发明还结合了目前成熟的商品化的对质粒中基因进行点突变的试剂盒，成功的对鼠伤寒沙门氏菌进行了基因的靶向点突变。
- 用于转化猪肺炎支原体的载体，转化的猪肺炎支原体菌株及其用途-201380046932.3
- 路易斯·冈萨雷斯冈萨雷斯;豪梅·皮诺尔列巴斯;霍尔迪·蒙塔内格拉特;玛利亚·卡马特斯马莱特;恩里克·奎尔罗穆里洛;玛尔塔·西塔亚阿尔诺 - 海博莱科学有限公司
- 2013-07-09 - 2019-04-16 - C12N15/74
- 本发明涉及猪肺炎支原体突变株，以及用于制备所述突变株的方法。其还涉及用于所述方法的载体、疫苗组合物以及包含用于针对猪地方性肺炎和其他猪疾病的所述突变株的接种试剂盒。本发明还涉及将猪肺炎支原体作为用于表达重组蛋白质和其他目的DNA序列的宿主的应用。
- 一种基因编辑方法在东方拟无枝酸菌中的应用-201811552697.8
- 倪瑶;魏维;钱秀萍;夏兴;戈梅 - 上海交通大学;上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司
- 2018-12-18 - 2019-04-12 - C12N15/74
- 本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，该方法将CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04引入东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007中，同时实现了基因敲除与敲入，可以简化遗传操作，提高东方拟无枝酸菌的整合效率。本发明还公开了一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04，将eGFP插入东方拟无枝酸菌的靶标序列，以便于检测基因编辑结果。本发明还公开了一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04的应用。
- 一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法-201510639204.4
- 佘群新;梁运祥;李英俊;潘赛夫;任敏;冯明霞;彭楠 - 华中农业大学
- 2015-09-30 - 2019-04-02 - C12N15/74
- 本发明一种利用内源CRISPR‑Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。在对含有内源CRISPR‑Cas系统的原核生物进行基因组编辑时，只需构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，在内源CRISPR系统对基因组发生DNA干涉后通过同源重组达到对基因组的编辑。其最大的优点在于：应用宿主范围广，所有含有内源CRISPR‑Cas系统的细菌和古菌均可操作；可用于多种编辑方式，缺失、插入和点突变等均可操作；更高的编辑效率，筛选阳性率高，背景低；流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组编辑的工作量。
- 专利分类
- 诊断分枝杆菌感染的方法及用于该方法的试剂
- 使用双重聚合酶链式反应对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法
- 使用双重实时聚合酶链式反应和解链曲线分析对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法
- 通过使用双重实时聚合酶链式反应对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法
- 结核分枝杆菌Rv3833基因在制备治疗结核分枝杆菌潜伏感染药物中的用途
- 鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法
- 新型小分子化合物、制备方法及在制备抗耐药结核分枝杆菌等分枝杆菌药物方面的用途
- 一种耐药结核分枝杆菌库构建方法
- 用于结核分枝杆菌复合群的CRISPR检测引物组及其用途
- 一种用于快速检测结核分枝杆菌药敏性的试剂盒及方法
