[发明专利]一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法有效
| 申请号： | 201510639204.4 | 申请日： | 2015-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN105331627B | 公开（公告）日： | 2019-04-02 |
| 发明（设计）人： | 佘群新;梁运祥;李英俊;潘赛夫;任敏;冯明霞;彭楠 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N15/70;C12N1/21 |
| 代理公司： | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人： | 龚莹莹;王敏锋 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明一种利用内源CRISPR‑Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。在对含有内源CRISPR‑Cas系统的原核生物进行基因组编辑时，只需构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，在内源CRISPR系统对基因组发生DNA干涉后通过同源重组达到对基因组的编辑。其最大的优点在于：应用宿主范围广，所有含有内源CRISPR‑Cas系统的细菌和古菌均可操作；可用于多种编辑方式，缺失、插入和点突变等均可操作；更高的编辑效率，筛选阳性率高，背景低；流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组编辑的工作量。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 利用 内源 crispr cas 系统 进行 生物 基因组 编辑 方法 | ||
【主权项】：
1.含有CRISPR‑Cas系统的原核生物在内源编辑原核生物基因组中的应用；所述的原核生物为含有内源I型或III型CRISPR‑Cas系统，或同时含有内源I型和III型CRISPR‑Cas系统的细菌或古菌；其应用方法包括：1)构建基因组编辑质粒：在原核生物基因组上拟编辑区域选取一段序列作为protospacer即靶标位点，根据protospacer设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5’‑AAAG‑Nn‑3’，反向引物：5’‑TAGC‑N’n‑3’，其中Nn和N’n为反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C，n表示protospacer的碱基个数；将上述两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer片段；人工CRISPR载体pSe‑Rp经过限制性内切酶BspMI酶切处理，然后与具有粘性末端的spacer片段酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒；再将包含突变序列和与宿主细胞基因组上靶标位点两端同源的供体DNA片段插入到上述人工CRISPR质粒上，得到基因组编辑质粒；2)突变株的获得：基因组编辑质粒电转入原核生物感受态细胞，质粒上的人工CRISPR簇转录出pre‑crRNA，pre‑crRNA在细胞内被加工成成熟的crRNA；crRNA与细胞内源的CRISPR‑Cas蛋白形成crRNP复合体，通过crRNA与宿主细胞基因组上的目标DNA链配对来识别靶标位点进行切割；质粒上的供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，进而得到基因组编辑突变株。
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- 刘胜;蒙亮;刘欣;王鹏;顿先才;徐国华;申婵;胡艳红 - 华中科技大学鄂州工业技术研究院;华中科技大学
- 2018-12-25 - 2019-04-26 - C12N15/74
- 本发明提供了一种利用短短芽孢杆菌制备高纯度隐地蛋白的方法，步骤包括：S1、将隐地蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中；S2、将步骤S1所得质粒转入短短芽孢杆菌宿主中；S3、发酵培养步骤S2所得短短芽孢杆菌，所述发酵培养的培养条件为：T2培养基、温度30～33℃、转速120～200rpm、发酵培养时间24～60h；S4、收集发酵后的菌液，分离提取隐地蛋白液；所述分离提取方法包括：离心菌液收集上清，对上清液进行切向流超滤获得滤液、超滤浓缩滤液即得隐地蛋白液。该方法能够简便快速的获取高纯度的隐地蛋白，且所得的隐地蛋白溶液直接用作农用抗菌抑菌剂能够达到明显促进植物生长的效果，具备良好的应用前景。
- 用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒及相应的基因靶向点突变方法-201811622618.6
- 刘永生;敬文宪;李学瑞;周建华;马丽娜;陈启伟 - 中国农业科学院兰州兽医研究所
- 2018-12-28 - 2019-04-19 - C12N15/74
- 本发明提供用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒，所述重组质粒含有Kan抗性基因与sacB基因片段。本发明还提供应用该重组质粒进行鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的方法。本发明结合red同源重组系统和自杀性质粒构建系统这两种方法的优点，成功构建了同时具备以上两种功能的重组质粒，同时本发明还结合了目前成熟的商品化的对质粒中基因进行点突变的试剂盒，成功的对鼠伤寒沙门氏菌进行了基因的靶向点突变。
- 用于转化猪肺炎支原体的载体，转化的猪肺炎支原体菌株及其用途-201380046932.3
- 路易斯·冈萨雷斯冈萨雷斯;豪梅·皮诺尔列巴斯;霍尔迪·蒙塔内格拉特;玛利亚·卡马特斯马莱特;恩里克·奎尔罗穆里洛;玛尔塔·西塔亚阿尔诺 - 海博莱科学有限公司
- 2013-07-09 - 2019-04-16 - C12N15/74
- 本发明涉及猪肺炎支原体突变株，以及用于制备所述突变株的方法。其还涉及用于所述方法的载体、疫苗组合物以及包含用于针对猪地方性肺炎和其他猪疾病的所述突变株的接种试剂盒。本发明还涉及将猪肺炎支原体作为用于表达重组蛋白质和其他目的DNA序列的宿主的应用。
- 一种基因编辑方法在东方拟无枝酸菌中的应用-201811552697.8
- 倪瑶;魏维;钱秀萍;夏兴;戈梅 - 上海交通大学;上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司
- 2018-12-18 - 2019-04-12 - C12N15/74
- 本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9编辑系统在东方拟无枝酸菌中进行基因敲除与敲入的方法，该方法将CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04引入东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007中，同时实现了基因敲除与敲入，可以简化遗传操作，提高东方拟无枝酸菌的整合效率。本发明还公开了一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04，将eGFP插入东方拟无枝酸菌的靶标序列，以便于检测基因编辑结果。本发明还公开了一种含有gtfD基因同源臂的CRISPR/Cas9编辑质粒pLYNY04的应用。
- 一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法-201510639204.4
- 佘群新;梁运祥;李英俊;潘赛夫;任敏;冯明霞;彭楠 - 华中农业大学
- 2015-09-30 - 2019-04-02 - C12N15/74
- 本发明一种利用内源CRISPR‑Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。在对含有内源CRISPR‑Cas系统的原核生物进行基因组编辑时，只需构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，在内源CRISPR系统对基因组发生DNA干涉后通过同源重组达到对基因组的编辑。其最大的优点在于：应用宿主范围广，所有含有内源CRISPR‑Cas系统的细菌和古菌均可操作；可用于多种编辑方式，缺失、插入和点突变等均可操作；更高的编辑效率，筛选阳性率高，背景低；流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组编辑的工作量。
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