[发明专利]一种评价抗虫转基因玉米对斑马鱼饲用安全性的方法

摘要

本发明公开了一种评价抗虫转基因玉米对斑马鱼饲用安全性的方法，通过配制含有抗虫转基因玉米和对照非转基因玉米的人工饲料，喂养斑马鱼98天，调查斑马鱼的各项生长指标、组织病理、脏器组织中的酶活及敏感蛋白mRNA表达水平等参数，从而系统地评估抗虫转基因玉米对斑马鱼的饲用安全性。

主权项

1.一种评价抗虫转基因玉米对斑马鱼饲用安全性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)饲料配制与检测饲料配方各成分质量百分比如下：22％的抗虫转基因玉米或对照非转基因玉米，34％的酪蛋白，18％的鱼粉，8％的明胶，6％的花生油，3％的鳕鱼甘油，4.5％的α‑纤维素，0.5％的氯化胆碱，1％的复合维生素，3％的矿物盐预混料；饲料配制前先将玉米用商用磨粉机打磨成粉，过100目筛网，饲料配制时将明胶溶于80℃左右的纯净水中搅拌均匀，按照比例“由小到大”的顺序依次填加其它饲料成分，添加过程中用搅拌机不断搅拌使其充分混合，混合均匀的饲料用家用料理机制作成直径1.5mm的条状平铺于托盘上，放置于阴凉处晾干，根据斑马鱼口径大小再进行研磨和过筛，使饲料颗粒直径为400～560μm，4℃冷藏；检测饲料的营养成分、饲料中转基因表达蛋白、霉菌毒素以及农药残留；(2)斑马鱼喂养实验选用遗传背景一致，体重和体长相近，鱼龄均为90天的斑马鱼为实验用鱼，随机分为两组，每组3个平行缸，每缸50条鱼。采用水生循环养殖系统饲养斑马鱼，用配制的含有抗虫转基因玉米和对照非转基因玉米的饲料分别喂食斑马鱼98天，每天喂食3次，每天喂食量为鱼体重的3～4％；(3)生长指标调查每缸随机取10条斑马鱼称湿重、测量体长，并根据测得的数据计算特定增长率和食物转化率；(4)组织病理学分析每缸随机取3条斑马鱼进行大体解剖，取肝脏、肠道和脑固定于10％福尔马林溶液进行脱水处理，然后制作成石蜡病理切片，进行组织病理学检查；(5)繁殖指标测定在试验的第98d，每缸随机取10对斑马鱼按照雌雄比1：2进行配对产卵，记录每对斑马鱼的产卵量、孵化率、孵化出仔鱼的畸形和异常行为；(6)脏器组织中酶活指标测定每缸随机取3条斑马鱼进行大体解剖，取其脏器组织样本，置于‑80℃冰箱冷冻，分别采用超氧化物歧化酶试剂盒和过氧化氢酶试剂盒检测斑马鱼脏器组织中的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶酶活性；(7)脏器组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、热激蛋白70和细胞色素P450酶基因mRNA表达测定每缸随机取3条斑马鱼进行大体解剖，取其脏器组织样本，用微量RNA提取试剂盒提取脏器组织总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA保存于‑20℃冰箱待用。根据斑马鱼超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、热激蛋白70和细胞色素P450酶基因的mRNA序列，应用引物设计软件Primer Premier5.0进行引物设计，引物如表1所示，表1采用实时荧光定量PCR检测脏器组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、热激蛋白70和细胞色素P450酶基因mRNA表达量，反应体系为：SYBR Green qPCR Master Mix 10μL，上下游引物10μmol/L浓度各0.4μL，ROX 0.4μL，样品cDNA模板1.0μL，无菌去离子水补足至20μL。扩增程序：95℃预变性，10min，然后95℃，15s，55℃，15s，72℃，45s，共45个循环。以β‑actin为内参基因，采用相对定量法2^‑△△Ct计算各基因mRNA的表达水平，其中△△Ct＝(Ct_目的基因‑Ct_内参基因)_试验组‑(Ct_目的基因‑Ct_内参基因)_对照组；(8)数据分析采用独立样本T‑test分析转基因玉米饲料组和非转基因玉米饲料组斑马鱼在体长、体重、特定生长率、饲料转化率、组织病理、繁殖指标、脏器组织中抗氧化酶活性以及敏感蛋白mRNA表达水平上的差异，如果差异显著，表明有显著影响；反之，无显著影响。