[发明专利]一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒在审
| 申请号： | 201910317012.X | 申请日： | 2019-04-19 |
| 公开（公告）号： | CN109988820A | 公开（公告）日： | 2019-07-09 |
| 发明（设计）人： | 童云广;王瓯晨;徐鹭芹 | 申请（专利权）人： | 奥明（杭州）基因科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/6886;C40B50/06;C12N15/11 |
| 代理公司： | 杭州知见专利代理有限公司 33295 | 代理人： | 赵越剑 |
| 地址： | 310018 浙江省杭州市江干区杭州经济技术开*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法及试剂盒，包括(1)样品采集与提取；(2)末端修复/磷酸化/加A；(3)添加含标签的接头序列；(4)捕获前扩增；(5)目的基因杂交捕获；(6)富集；(7)捕获后扩增。本发明基于二代数字分子标识符(DMI)和双链双标签双重纠错(DSDC)技术，可有效降低深度测序PCR扩增或测序中发生的错误，提高检测灵敏度，同时针对反应体系和杂交洗涤液进行了优化，能对目标基因进行有效富集，降低样本量的要求。可用于乳腺癌的靶向治疗、临床试验以及疗效评估涉及基因检测的技术领域。 | ||
| 搜索关键词： | 乳腺癌 扩增 多基因检测 文库构建 试剂盒 捕获 标识符 检测灵敏度 杂交洗涤液 靶向治疗 基因检测 接头序列 疗效评估 临床试验 末端修复 目标基因 目的基因 样品采集 有效富集 杂交捕获 测序PCR 磷酸化 双标签 样本量 测序 富集 可用 双链 纠错 标签 优化 | ||
【主权项】：
1.一种用于乳腺癌多基因检测的文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品采集与提取：收集外周血，分离血浆，并提取游离核酸DNA；(2)末端修复/磷酸化/加A：对提取到的游离核酸DNA进行末端修复、磷酸化及加A；(3)添加含标签的接头序列：将步骤(2)处理后的游离核酸DNA与含标签的接头序列混合，PCR反应，纯化后得标签‑靶标DNA；(4)捕获前扩增：对标签‑靶标DNA进行PCR扩增，然后进行纯化，获得基因组DNA文库；(5)目的基因杂交捕获：使用Hyb Block将基因组DNA文库进行杂交前的封闭，然后使用捕获探针与基因组DNA文库进行杂交捕获；(6)富集：对步骤(5)捕获到的靶序列采用磁珠富集法进行富集；(7)捕获后扩增：对步骤(6)富集后的靶序列进行PCR扩增，纯化后获得目的基因文库。
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- 示例方法包括通过使第一溶液流过在流动池上的扩增位点使第一溶液在流动池上反应以及随后使不同的第二溶液流过扩增位点使第二溶液在流动池上反应。第一溶液包含靶核酸和第一试剂混合物，该第一试剂混合物包含核苷三磷酸和复制酶。第一溶液中的靶核酸以一个转运速率转运至扩增位点并且与扩增位点结合。第一试剂混合物扩增与扩增位点结合的靶核酸，以产生源自对应的靶核酸的扩增子的克隆群体。扩增子以超过转运速率的扩增速率产生。第二溶液包含第二试剂混合物，并且缺乏靶核酸。第二溶液用于增加扩增位点处的扩增子的数目。
- 基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法-201910318823.1
- 马晓玲;刘冬梅 - 上海三誉华夏基因科技有限公司
- 2019-04-19 - 2019-09-17 - C12Q1/6806
- 本发明公开了基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法，属于核酸检测技术领域。本发明通过设计捕获探针引物，然后与基因组DNA进行杂交反应，得到目的DNA片段后进行延伸、连接反应，后对目的DNA片段进行PCR扩增，纯化后即可进行文库测序。本发明的靶向区域捕获建库方法比较灵活，特异性高，捕获效率高，操作简单，耗时较短，并且能够尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。
- 一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法及其应用-201611043650.X
- 安然;梁兴国;王鹏飞 - 青岛千卓分子生物科技有限公司
- 2016-11-24 - 2019-09-10 - C12Q1/6806
- 本发明涉及一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法，具体如下：将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混匀后2‑20℃放置0.5‑12小时，得到稳定的DNA复合物溶液，可直接添加至液态产品中；所述的氨基磷酸比为聚阳离子所携带的氨基摩尔数与DNA携带的磷酸基团摩尔数的比值。该方法中聚阳离子化合物可以提高外源DNA对核酸酶、酸和自由基等条件的耐受性，使其可作为溯源和防伪的内标物在液态产品或商品中长期稳定存在。
- 一种新的基因组甲基化文库的构建方法和应用-201810162430.1
- 戴珩;柴燕群;章扬;黄炳顶;史耀舟;张伟 - 上海鲸舟基因科技有限公司
- 2018-02-27 - 2019-09-03 - C12Q1/6806
- 本发明提供了一种甲基化测序文库的构建方法。具体地，本发明通过重亚硫酸盐处理构建文库，可同时检测经CT转化的原始链和未经CT转化的互补链序列，直接找出甲基化位点；本发明构建的文库保留了一半未经CT转化的碱基，可大大提高文库碱基平衡性，大幅提高测序质量。
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