[发明专利]一种高效获得T-DNA插入侧翼序列的方法及其应用

摘要

本发明涉及Transfer DNA(T‑DNA)插入真核生物基因组后，其相关插入位点侧翼序列信息获得的方法及其应用，属于生物技术研究领域。本发明在双元质粒T‑DNA区域的左边界(Left Border)或者右边界(Right Border)附近设计一条生物素标记的特异引物；利用该引物可以同时结合靶标序列片段以及链霉亲和素的特性，将含有T‑DNA插入的边界核酸序列分离并纯化；接着将一个已知序列的接头连接到纯化片段的5’端，并进行PCR扩增；最后将PCR序列克隆至载体测序，获得插入序列信息。和传统的iPCR和TAIL‑PCR相比，该方法可以显著提高鉴定T‑DNA插入位点的效率和准确率。

主权项

1.一种高效获得TransferDNA(T-DNA)插入基因组DNA位点侧翼序列的方法，其技术特征如下：A.在双元质粒T-DNA区域的左边界(Left Border)或者右边界(Right Border)附近设计一条生物素标记的特异引物；B.合成一条引物，其序列和上述生物素标记的引物序列必须反向互补；C.合成一条双链DNA接头，该接头的5’端为平末端，3’端为一个T碱基突出的粘性末端；D.合成一对Polymerase Chain Reaction(PCR)引物，上游引物序列为部分接头序列，下游引物序列为T-DNA的靠近Left Border或者Right Border的序列，且必须在生物素标记引物位点和Left Border(或者Right Border)序列之间；E.将目的基因组DNA用超声波破碎仪随机打断，片段大小在400-1000bp之间；F.上述破碎后的基因组DNA为模板，依次加入生物素标记的引物，PCR反应所必须的组分，进行1个循环的PCR扩增；G.扩增期间，在PCR延伸阶段暂停，保持当前温度，加入B合成的反向互补引物并小心吹吸混匀；H.利用链霉亲和素(streptavidin)磁珠纯化PCR产物，并用T7连接酶将该纯化产物与C合成的接头进行连接反应；H.用磁珠法纯化并回收大小在300-1000bp之间的片段，并将纯化后的片段作为模板，用D中合成的引物再次进行PCR扩增；I.扩增后的产物进行电泳，并回收大小在600-1000bp之间的片段；J.将回收的片段克隆至T载体上，然后测序。