[发明专利]骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途

摘要

骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途，本发明专利制备方法如下：提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA，用RT‑PCR方法扩增抗体轻链可变区基因和重链可变区基因通过重叠延伸拼接PCR方法，在VL和VH基因之间引入Linker3，连接成单链抗体SOST‑scFv。将测序正确的scFv基因克隆至表达载体PET‑22b(+)后转入E.coliBL21进行可溶性表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS‑PAGE鉴定表达产物，ELISA和West‑blot检测表达蛋白的反应活性。本发明专利具有分子量小、渗透性高、抗原结合活性高、显著的促进骨生成抑制骨流失的优点。

主权项

1.一种骨硬化蛋白单链抗体组合物的制备和LC‑MS分析方法，其特征在于包括以下步骤：0.5ug骨硬化蛋白单链抗体加入5.0g精氨酸，5.0g天门冬氨酸，加入注射用水，溶解，稀释至1000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖；上述冷冻干燥分为四个阶段：(1)预冻3小时，温度在‑30℃；(2)减压干燥14小时，温度在‑30℃；(3)升温干燥4小时，温度在‑15℃；(4)二次升温干燥4小时，温度在30℃；骨硬化蛋白单链抗体，序列为：SEQ‑1；骨硬化蛋白单链抗体的组合物的LC‑MS分析色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18column(1.7μm，100mm×2.1mm)；预柱：Acquity UPLC BEH C18 Van Guard pre‑column(1.7μm，5mm×2.1mm)；柱温：35℃；样品槽：5℃；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；流动相：A：乙腈；B：1.0％的乙酸甲醇溶液梯度条件：取骨硬化蛋白单链抗体组合物的样品用：流动相A(80％)、流动相B(20％)(体积比)的混合溶液溶解；MS分析选用负离子模式，在以下条件下进行：离子源温度：150℃；脱溶剂温度：380度；脱溶剂(N2)流速(L/Hr)700；锥孔气(N2)流速(L/Hr)60；毛细管电压(Kv)2.75；锥孔电压(V)60；全扫描质谱范围母离子为m/z 50～10000，子离子为m/z 50～1000；LC‑MS数据分析采用仪器随带的Finnigan Xcalibur 1.3软件进行。