[发明专利]高通量筛选ALKBH5小分子抑制剂的方法在审
| 申请号： | 201710985600.1 | 申请日： | 2017-10-20 |
| 公开（公告）号： | CN107557430A | 公开（公告）日： | 2018-01-09 |
| 发明（设计）人： | 刘宏民;申丹丹;郑一超 | 申请（专利权）人： | 郑州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/32 | 分类号： | C12Q1/32;C12Q1/26;G01N21/64 |
| 代理公司： | 郑州联科专利事务所(普通合伙)41104 | 代理人： | 时立新 |
| 地址： | 450001 河南*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明涉及药物化学领域，具体公开了利用FDH酶联荧光原理和AlphaScreen技术分别筛选ALKBH5小分子抑制剂的方法。该方法先成功构建并原核表达纯化得到纯度较高的ALKBH5重组蛋白，合成m6A修饰的ssRNA作为底物。用FDH酶联荧光原理和AlphaScreen技术检测ALKBH5的活性并建立其小分子抑制剂筛选平台。FDH酶联荧光反应体系稳定，所用试剂便宜，易得，背景低；AlphaScreen反应体系稳定，受到样品的干扰非常少，假阳性假阴性均低，可去除天然产物自发荧光的干扰，灵敏度高；这两种方法均易于实现微型化，通量高且相互补充，可实现ALKBH5小分子抑制剂的筛选。 | ||
| 搜索关键词： | 通量 筛选 alkbh5 分子 抑制剂 方法 | ||
【主权项】：
一种筛选ALKBH5小分子抑制剂方法，其特征在于，利用酶联荧光原理筛选ALKBH5小分子抑制剂，具体方法如下：（1）以pET‑28b为表达载体，FDH全长基因序列为活性片段，将其克隆到表达载体上，构建并原核表达纯化FDH重组蛋白；（2）以pMCSG19为表达载体，ALKBH5全长基因序列为活性片段，将其克隆到表达载体上，构建并原核表达纯化ALKBH5重组蛋白；（3）以不同浓度的甲醛作为底物检测FDH的活性，作标准曲线，确定底物浓度；然后以ssRNA作为ALKBH5的底物，检测ALKBH5的活性；（4）缓冲溶液中，加入FDH和ALKBH5重组蛋白，NAD作为FDH的辅酶，α‑酮戊二酸，Fe2+作为ALKBH5的辅酶，根据NADH在360nm，460nm的荧光强度筛选ALKBH5抑制剂；底物ssRNA浓度选10µM‑40µM。
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- 一种基于DAB显色的低温CPC乙酰化酶高通量筛选的方法，该方法基于对二甲氨基苯甲醛与7-ACA的复合物在405nm有最大吸收峰的原理，采用无菌的96孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达，以稀碱溶液进行菌体裂解后利用磷酸二氢钠中和，然后再以96孔板进行底物的水解，经p-DAB显色后利用酶标仪进行产物的快速定量，进而实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。该方法具有筛选快速、操作简便、筛选通量大及准确度高等优点，能够加快CPC乙酰化酶改造的速度，有巨大的应用潜力和经济价值。
- 一种高通量筛选羰基还原酶活性和对映选择性的方法-201410457947.5
- 吴洽庆;冯进辉;陈曦;马延和;朱敦明 - 中国科学院天津工业生物技术研究所
- 2014-09-11 - 2016-04-06 - C12Q1/32
- 本发明公布了一种高通量筛选羰基还原酶活性和立体选择性的方法，该方法利用羰基还原酶氧化时生成的辅因子NAD（P）H和偶氮染料为底物，利用偶氮还原酶将偶氮染料还原引起的颜色变化实现羰基还原酶的高通量筛选。本发明的方法可以快速有效的实现羰基还原酶的筛选，并且可以在96孔板或者是384孔板中实现，该方法既可以在利用检测紫外波长变换进行检测，也可以利用肉眼直接观察，是一种非常可靠的筛选方法。
- 一种甘胆酸测定试剂盒及其使用方法-201510578138.4
- 黄争上 - 绍兴圣康生物科技有限公司
- 2015-09-14 - 2015-12-09 - C12Q1/32
- 本发明公开了一种甘胆酸测定试剂盒，包括第一检测液、第二检测液，第一检测液包括三羟甲基氨基甲烷、葡萄糖六磷酸、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型、兔抗人甘胆酸多克隆抗体、第一检测液牛血清白蛋白；第二检测液包括三羟甲基氨基甲烷、葡萄糖六磷酸脱氢酶-甘胆酸偶联物、第二检测液牛血清白蛋白。本发明所述的一种甘胆酸测定试剂盒及其使用方法，其均相酶免疫法，操作简单，准确性高，便于推广。
- 用于监测生物流体的系统和方法-201380071036.2
- K.E.霍夫达;P.乌尔达尔;G.贾德霍尔特;D.雅各布森 - 奥斯陆大学医院
- 2013-11-20 - 2015-09-23 - C12Q1/32
- 本公开涉及用于诊断、研究和筛选生物流体(例如，与甲醇中毒、乙醇水平和乙二醇中毒有关)中的化学品的组合物和方法。具体地说，本公开涉及用于检测生物流体中的甲酸或甲酸盐、乙醇、乙二醇和其它临床相关化学品的现场护理系统和方法。
- 专利分类
