[发明专利]一种提高脂肪细胞移植成活率的方法

摘要

本发明公开了一种提高脂肪细胞移植成活率的方法，它涉及细胞移植技术领域。所述的提高脂肪细胞移植成活率的方法为步骤一、脂肪干细胞获取，步骤二、脂肪细胞获取，移植，在处理脂肪细胞的同时收获培养的脂肪干细胞，计数；将脂肪干细胞与脂肪细胞按21比例进行混合；得到的细胞悬液进行移植到相应部位。脂肪干细胞的获取步骤较为简单，脂肪干细胞能够分泌多种生长营养因子，改善组织器官内部的微环境，因此，利用自体脂肪干细胞与脂肪细胞共移植无疑可以大大改善脂肪细胞填充后因缺乏养分而造成的死亡，从而提高脂肪细胞的移植成活率。

主权项

一种提高脂肪细胞移植成活率的方法，其特征在于：提高脂肪细胞移植成活率的方法为：步骤一、脂肪干细胞获取，1‑1、将吸脂来源的脂肪组织放入预冷含1%双抗的生理盐水中，密封，低温条件下,2‑8℃下送回实验室；1‑2、将上述脂肪组织用生理盐水冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，把脂肪组织放入离心管中，记录原始体积，向组织中加入等体积的消化液，所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%I型胶原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃气浴振荡器中消化30min，然后将消化好的组织静置5min，此时液面分为3层，上层黄色油状物是破碎的脂肪细胞释放的脂滴，中层为大颗粒脂肪细胞层，间或混合少量纤维，下层为单个核细胞层；1‑3、弃掉上层和中层细胞，将下层的细胞悬液以1500r/min，离心10min后弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，用非动物源血清L‑DMEM培养液将其重悬，密度调整到1×105个/mL，然后接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中；1‑4、在 37℃下5%的CO2条件下培养；1‑5、当脂肪干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代，首先，用生理盐水冲洗一遍细胞，然后加入3mL的混合酶溶液，所述的混合酶溶液由0.25%胰酶和0.04%的EDTA在体积为为1:1情况下配置而成,消化，当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形，缩成球状后，立即用等体积的培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底部，确保细胞完全脱落至悬液中，1000r/min，离心5min，然后，将离心得到的细胞团重悬，调整密度后按1:2进行接种；1‑6、在37℃，5%的CO2条件下传代培养；1‑7、细胞冻存，冻存细胞前在12h内进行换液，具体步骤与步骤1‑5相同，即弃去培养液，生理盐水洗一遍，加入消化液，待消化完成后，中止消化；轻轻吹打使细胞悬浮于生理盐水中，1000r/min，离心5min；弃上清，再用生理盐水洗一遍，计数；最后加入冻存液,所述的冻存液中无血清L‑DMEM培养液：人血白蛋白：DMSO=5:4:1，使得细胞密度为1×106个/mL左右；分装至2mL冻存管中，每管1mL‑1.5mL；将冻存管放入程序降温盒内，然后放入‑80℃冰箱过夜，转至液氮罐内长期储存；1‑8、细胞复苏，从液氮中迅速取出冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅中，并不断晃动，使其完全溶化；无菌条件下，将细胞转移至含5mL无血清L‑DMEM培养液离心管中，在1000r/min情况下，离心5min，弃上清；重复洗一遍；加入适量非动物源血清L‑DMEM培养液后接种于培养瓶中；37℃、5%CO2条件下培养，待用；步骤二、脂肪细胞获取，2‑1、将吸脂来源的脂肪组织用生理盐水冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，把脂肪组织放入离心管中，记录原始体积；2‑2、向组织中加入等体积的消化液,所述的消化液由0.25%胰酶，0.1%的I型胶原酶，以1:1比例混合配制而成，放入37℃气浴振荡器中消化30min，然后将消化好的组织静置5min，待其分层后，用吸管吸取位于悬液中层的脂肪细胞，用细胞筛网过滤，并将过滤后的细胞悬液以1000r/min，离心2min后弃掉下层悬液得到脂肪细胞；2‑3、用生理盐水悬浮细胞，计数；步骤三、移植，3‑1、在处理脂肪细胞的同时收获培养的脂肪干细胞，计数；3‑2 、将脂肪干细胞与脂肪细胞按2:1比例进行混合；3‑3 、将步骤3‑2中得到的细胞悬液进行移植到相应部位。