[发明专利]一种用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种可用于非小细胞肺癌基因突变检测的优化的测序文库构建方法和试剂盒。方法包括一管式反应完成基因组DNA打断至接头连接，连接产物扩增后与非小细胞肺癌相关基因目标区域探针进行杂交捕获，之后进行BGISEQ‑500/1000平台测序及数据分析得到突变发生情况。基于一管式反应极大的优化了实验流程，减少操作复杂性和时间，降低了对临床样本起始量的要求；一次性可检测多基因多位点，覆盖点突变、插入缺失、结构变异及拷贝数变异，检测结果准确并弥补了PCR捕获方法无法一次性检测结构变异的不足，大大提升高通量测序应用于非小细胞肺癌基因突变检测的实效性。本发明的覆盖面广、性价比高，可为医师诊断、治疗和用药提供参考依据，适于大规模推广应用。

主权项

一种用于非小细胞肺癌相关基因突变检测的文库构建方法，其特征在于，所述方法包括：i.在反应管中加入基因组DNA，DNA打断酶和打断反应缓冲液；在DNA打断酶的作用下，基因组DNA被随机片段化处理，产生DNA分子片段；ii.在所述反应管中，直接加入聚合酶、多聚核苷酸激酶、不具有3’‑5’外切活性的聚合酶、dNTP、dATP及多聚核苷酸激酶缓冲液，进行末端修复与加A反应；在同一反应体系中，在dNTP存在下，利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平，利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基；在过量dATP存在下，利用不具有3’‑5’外切活性的聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP；iii.在所述反应体系中，直接加入鼓泡型接头、DNA连接酶和连接反应缓冲液，所述鼓泡型接头的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端；使上一步产生的3’A突出的双链DNA与所述鼓泡型接头连接；iv.纯化上一步接头连接的产物后，加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增，其中一条引物5’末端有磷酸化修饰，得到大量双链DNA，其中一条链的5’端有磷酸基团；v.使用非小细胞肺癌探针对上一步PCR扩增得到的产物进行非小细胞肺癌目标区域捕获；vi.对上一步非小细胞肺癌目标区域捕获的产物，加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增，其中一条引物5’末端有磷酸化修饰，得到大量双链DNA，其中一条链的5’端有磷酸基团；vii.纯化上一步PCR扩增的产物后，利用热变性将所述双链DNA变成单链脱氧核酸，并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸作为介导桥序列，与变性后的单链脱氧核酸杂交及连接反应，使目的单链核酸环化，得到所述文库。