[发明专利]一种氨基酸神经四肽的合成方法

摘要

本发明公开了一种氨基酸神经四肽的合成方法，包括叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂的合成、叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的合成、碱性蛋白酶的预处理、叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂脱保护、叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂合成、叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护、苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护、肽产物分离纯化，本发明在非水介质中酶法合成了氨基酸神经四肽Phe‑Arg‑Trp‑Gly，四肽合成时选择有机溶剂叔丁醇，并采用在非水有机溶剂中加入三乙胺助溶剂和适当增加水含量，来增加亲水氨基酸的溶解度，解决了亲水氨基酸的利用问题。

主权项

一种氨基酸神经四肽的合成方法，其特征在于，该氨基酸神经四肽的合成方法包括以下步骤：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂的合成：叔丁氧羰基苯丙氨酸加入质量为0.53g，精氨酸甲脂加入质量为1.04g，有机溶剂二甲基甲酰胺20ml，1ml三乙胺，三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液，加入胰凝乳蛋白酶2g，40℃水浴振荡3天，每隔8h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的合成：BOC‑Trp加入质量为0.16g，Gly‑OEt加入质量为0.62g，有机溶剂二甲基甲酰胺20ml，1ml三乙胺，三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液，加入胰凝乳蛋白酶2g，40℃水浴振荡3天，每隔8h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；碱性蛋白酶的预处理：取2ml碱性蛋白酶和15ml无水乙醇置于离心管中，旋涡振荡5分钟使其充分混合，混合物3000rpm离心10分钟，碱性蛋白酶与溶剂无水乙醇完全分开，倾去上层的乙醇，此步操作重复三次；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的处理：将含有叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂的有机溶剂二甲基甲酰胺，分别减压蒸馏除去有机溶剂二甲基甲酰胺，再用乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯分别用冷柠檬酸洗三次，冷的碳酸氢钠洗两次，再用冷水洗两次，减压蒸馏，除乙酸乙酯，得微黄色无定型物；叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：叔丁氧羰基色氨酸甘氨酸乙脂产物用TFA苯甲醚＝9:1刚好溶解，0℃振荡2‑4小时后加入乙醚：石油醚＝1:3，得沉淀，离心，再加入由乙醚与石油醚按照1:3比例混合构成的混合液洗沉淀，得色氨酸甘氨酸乙脂；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂合成：取2mmol的叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸甲脂和4mmol的色氨酸甘氨酸乙脂加入锥形瓶，加入有机溶剂叔丁醇20ml，碱性蛋白酶2ml，1ml三乙胺，Na2CO3‑NaHCO3缓冲液，37℃水浴振荡24小时，每隔4h取50μl加入500μl冰乙酸终止反应，用质谱检测产物的生成；叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：叔丁氧羰基苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂产物用TFA:苯甲醚＝9:1刚好溶解，0℃振荡2‑4小时后加入乙醚：石油醚＝1:3，得沉淀，离心，再加入由乙醚与石油醚按照1:3比例混合构成的混合液洗沉淀，得苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂；苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂脱保护：取4.4g苯丙氨酸精氨酸色氨酸甘氨酸乙脂，加入24ml甲醇，2mol/L的NaOH12.5ml，反应一小时，用1mol/L的HCl调节pH至7，抽去甲醇，加水稀释，过滤，冰浴冷却，水洗到中性，得氨基酸神经四肽，用质谱检测产物；肽产物分离纯化：柱料采用Sephadex G－10，层析柱为16mm×1000mm，洗脱液采用蒸馏水，检测波长为220nm，流速为1.0ml/min，取100g SephadexG‑10干柱料，加500ml蒸馏水浸泡过夜，减压除气泡后装柱，洗脱液平衡过夜，待分离液体0.5ml上样层析，收集产品峰，冻干得产物。