[发明专利]一种人毛囊干细胞库的构建方法

摘要

本发明公开了一种人毛囊干细胞库的构建方法，包括供者毛发的采集、获取和分离人毛囊干细胞、人毛囊干细胞的培养、人毛囊干细胞的检测与冻存、建库等步骤。本发明的方法，可有效的分离、纯化和扩增人毛囊干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立出长期储存人毛囊干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量的干细胞资源。根据获取的人毛囊干细胞构建干细胞库，该库为健康成人储存毛囊干细胞，为其本人在患病需要采用干细胞治疗时，提供临床适用型人毛囊干细胞，并且在取得许可后，可将所储存的人毛囊干细胞用于干细胞制剂生产。

主权项

一种人毛囊干细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)  供者毛发的采集：采集供者毛发之前，进行采集至少包括供者身份识别信息的信息；然后对供者进行包括ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的毛发；2)  获取和分离人毛囊干细胞：在无菌条件下，挑取毛乳头完整的毛发，获取毛囊根部，用含有双抗的平衡磷酸盐缓冲溶液反复冲洗3‑5次得到毛囊；接着在无菌状态下将毛囊放入6孔板中，添加毛囊干细胞培养液600μL/孔，在37℃，5%CO₂的培养箱中培养，次日补液至3mL/孔继续培养，每2‑3天更换新鲜的毛囊干细胞培养液，待长至密度为80‑90%时即得到原代人毛囊干细胞；3)  人毛囊干细胞的培养：将步骤2）获得的原代人毛囊干细胞以0.1×10⁵‑1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养装置中，加入新鲜的毛囊干细胞培养液，置于37℃、5%CO₂的条件下培养，每2‑3天更换新鲜的毛囊干细胞培养液，待细胞长至密度为80‑90%融合时，去除之前的培养液，用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，接着加入0.25%‑0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3‑5分钟，待细胞全部脱落后，加入等体积的毛囊干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；然后将终止消化后的人毛囊干细胞悬液转移至离心管中，800‑1000转/分钟离心5‑6分钟，结束后去除上清液，加入新鲜的毛囊干细胞培养液重悬，之后1:3或者1:4传代，获得更多的人毛囊干细胞；4) 人毛囊干细胞的检测与冻存：人毛囊干细胞的检测：待人毛囊细胞长至密度为80‑90%融合时，去除之前的培养液，用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，接着加入0.25%‑0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3‑5分钟，待细胞全部脱落后，加入等体积的毛囊干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；然后将终止消化后的人毛囊干细胞悬液转移至离心管中，800‑1000转/分钟离心5‑6分钟，结束后去除上清；将收获的一部分人毛囊干细胞进行确定细胞是否达到合格标准的质量检测，所述质量检测至少包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测；其余同批次人毛囊干细胞进行细胞冻存；人毛囊干细胞的冻存：将上述获得的同批次的人毛囊干细胞利用人毛囊干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存管中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到‑196℃的液氮中长期保存；细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测；其中，人毛囊干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理；5)  建库：在储存入库的容器载体上建立人毛囊干细胞的相关信息，将前述所采集的供者的基本信息和相应人毛囊干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人毛囊干细胞库管理，即完成人毛囊干细胞库的构建。