[发明专利]人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法在审

专利信息
申请号: 201510199002.2 申请日: 2015-04-23
公开(公告)号: CN104845931A 公开(公告)日: 2015-08-19
发明(设计)人: 齐念民;高剑 申请(专利权)人: 上海坤爱生物科技有限公司
主分类号: C12N5/0775 分类号: C12N5/0775;A01N1/02
代理公司: 上海汉声知识产权代理有限公司 31236 代理人: 胡晶
地址: 201318 上海市浦东新区周*** 国省代码: 上海;31
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摘要: 发明公开了一种人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法,主要步骤包括:成人乳汁的采集;获取和分离人乳干细胞;培养人乳干细胞;检测、冻存人乳干细胞;建库。利用本发明的获取人乳干细胞的方法,可有效的分离、纯化、扩增人乳干细胞,解决此类资源得不到充分利用的现状,并建立长期储存人乳干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量的干细胞资源。根据本发明的方法获取的人乳干细胞构建干细胞库,其来源丰富,细胞获取简便,该库为健康成人储存人乳干细胞,为其本人在患病需要采用干细胞治疗时,提供临床适用型脂肪干细胞,并且可以在取得许可后,将所储存的人乳干细胞用于干细胞制剂的生产。
搜索关键词: 干细胞 获取 方法 构建
【主权项】:
一种人乳干细胞库的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)人乳汁的采集:采集乳汁之前,采集供者的可确认身份的信息,并对供者进行至少ABO/Rh血型的检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测,然后在无菌条件下采集供者的乳汁;(2)获取和分离人乳干细胞:将采集的乳汁在无菌条件下加入营养液稀释,之后在转速为250‑800 g下离心10‑20min,去除上层的油脂和乳状液体,底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗,最后用干细胞培养液重悬细胞,并接种至细胞培养装置中,在37℃、5%CO2的条件下培养,每2‑3天更换新鲜的干细胞培养液,待长至密度为80‑90%时即得到原代人乳干细胞;(3)人乳干细胞的培养:将获得的原代人乳干细胞以0.1×105‑1.0×105个细胞/cm2的密度接种在细胞培养装置中,待细胞长满后,去除旧培养液,用平衡磷酸盐缓冲溶液清洗,之后使用0.25%消化液消化,直至肉眼见单层细胞呈块状脱落或在显微镜下观察到细胞之间分离,立刻加干细胞培养液终止消化,轻柔吹打成单细胞;之后800‑1000rpm离心5‑6分钟,弃上清,加干细胞培养液进行轻柔吹打;将细胞悬液1:4传到细胞培养装置中,每个装置加入干细胞培养液进行培养,期间不用换液,以获得更多的人乳干细胞;(4)人乳干细胞的检测与冻存:人乳干细胞的检测:待人乳干细胞长至密度为80‑90%融合时,去除之前的培养液,用平衡磷酸盐缓冲溶液清洗,接着加入0.25%‑0.5%含EDTA的胰酶,在37℃条件下消化3‑5分钟,待细胞全部脱落后,加入等体积的干细胞培养液,吹打均匀,以终止消化;将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中,800‑1000rpm离心5‑6分钟,结束后去除上清,收获得到人乳干细胞;将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测,所述质量检测包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测,以确定细胞是否达到合格标准,其余同批次所得人乳干细胞进行细胞冻存;人乳干细胞的冻存:将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬,调整细胞密度为1×106~1×107个/mL,分装入冻存容器中,封盖,并做好编号,立即进行程序式降温,之后放入到‑196℃的液氮中长期保存;细胞冻存时做好所有的冻存记录,符合干细胞冷冻保存的标准,储存环境定期检测;其中,人乳干细胞的检测与冻存同时进行,即当检测结果出来之后,细胞已经冻存,这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃,做好记录,之后由专门人员进行处理;(5)建库:在储存入库的容器载体上建立人乳干细胞的信息,将前述所采集的供者的可确认身份的信息和相应人乳干细胞制备及其细胞库构建过程的信息录入计算机数据库,并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实,纳入人乳干细胞库管理,即完成人乳干细胞库的构建。
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  • 本发明属于干细胞制备领域,尤其涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法。本发明采用了一种脐带间充质干细胞的制备方法,即采用了组织块贴壁的方法制备脐带间充质干细胞,即将脐带清洗后,去除脐带动脉和静脉膜,用手术剪刀剪成小的组织块,再将组织块筛选清洗后,贴在培养皿底部,经37度烤干后,加入培养液,置于CO2培养箱中培养,12‑‑14天后消化、收集细胞。使用该方法成功收集了足量的脐带间充质干细胞。使用该方法成功收集了足量的脐带间充质干细胞,从而解决了现有的组织块法收获细胞效率低下的问题。
  • 一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法和诱导分化应用-201910565899.4
  • 袁勇;王伟舟;郭皓;赵刚;郭立;赵泽玉;邱俊杰;杨康;姚向宇;贺天磊 - 昆明医科大学第二附属医院
  • 2019-06-27 - 2019-09-27 - C12N5/0775
  • 本发明公开了一种人骨髓间充质干细胞株的建立方法和诱导分化应用,本发明提取的股骨干髓腔来源的骨髓间充质干细胞纯度高、活性好,完全能够满足干细胞成骨诱导分化等一系列实验,提取的骨质疏松患者骨髓间充质干细胞与正常人的相比转录组学上存在表达差异,为进一步揭示骨髓间充质干细胞在骨质疏松症的发病机制和寻找新的治疗靶点,提供了新的思路和方法。同时,针对骨质疏松症等骨髓间充质干细胞含量较少的样本,本技术亦能有效增加提取后的细胞获得量,增加贴壁细胞数量,促进细胞更快进入对数生长期,减少培养时间,降低培养成本,更易于保持骨髓间充质干细胞的细胞干性,从而满足成骨分化、干细胞治疗等一系列实验需求。
  • 一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法-201910612981.8
  • 李哲浩 - 赛瑞诺(北京)生物科技有限公司
  • 2019-07-09 - 2019-09-27 - C12N5/0775
  • 本发明涉及一种人源脐带间充质干细胞的培养和冻存方法,所述培养方法包括先从脐带组织中分离培养原代种子细胞,然后将原代种子细胞进行扩大培养的步骤,本发明通过在原代种子细胞培养阶段,创造性的采用第二次原代贴壁培养的方法,大幅缩短了原代种子细胞分离培养时间,提高了原代种子细胞数量,提高了原代种子细胞纯度,为临床研究和应用提供了充足的标准化种子细胞和培养方法。本发明制备得到的人源脐带间充质干细胞,在体、内外均可以向成骨、成软骨、成脂分化。本发明所述冻存方法通过采用无血清冻存液冻存体系,保证了所冻存细胞无动物源成分,且不使细胞受损,复苏后细胞活性好。
  • 一种诱导脂肪干细胞成软骨分化的完全培养液及制备方法-201910648547.5
  • 杨慧慧 - 杨慧慧
  • 2019-07-18 - 2019-09-27 - C12N5/0775
  • 本发明提供了一种诱导脂肪干细胞成软骨分化的完全培养液及制备方法,本发明的一种诱导脂肪干细胞成软骨分化的完全培养液是向1L无菌蒸馏水中,依次加入0.003~0.005g的氧化胆碱样品的制备、1~2g的氨基酸样品、10~12g的无机盐、0.003~0.005g的偏多酸钙、0.003~0.005g的叶酸、0.007~0.0075g的肌醇、0.003~0.005g的烟酰胺、0.003~0.005g的吡哆醇、0.0003~0.0005g的核黄素、0.003~0.005g的硫胺素、4~5g的葡萄糖样品和0.01~0.02g的酚红混合均匀即得一种诱导脂肪干细胞成软骨分化的完全培养液,本发明的诱导脂肪干细胞成软骨分化的完全培养液可以诱导脂肪干细胞快速的分化。
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