[发明专利]一种以大豆慢生根瘤菌全细胞拆分消旋体β‑内酰胺的方法

摘要

一种以大豆慢生根瘤菌全细胞拆分消旋体β‑内酰胺的方法，属于分离技术领域。大豆慢生根瘤菌全细胞转化拆分3‑羟基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮、3‑乙酰氧基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮具有非常高的催化效率，能够获得具有较高纯度的单一构型化合物。其中，（3R,4S）3‑羟基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮e.e值为99.99%，目标产物相对收率99%，总收率49.5%；（3R,4S）3‑乙酰氧基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮e.e值为99.88%，目标产物相对收率93.58%，总收率46.79%。

主权项

利用大豆慢生根瘤菌全细胞转化消旋体β‑内酰胺制备(‑)β‑内酰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)作为菌种；菌种保藏号为CGMCC No.1.2550；(2)发酵液制备：将保存的大豆慢生根瘤菌菌种接种至根瘤菌无菌液体培养基中，振荡培养，获得菌株发酵液；(3)菌体收集：将上述的菌株发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液进行混合，得到稀释发酵液；将稀释发酵液进行多次离心，收集菌体沉淀；将菌体沉淀用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液再次洗涤处理，回收得到湿菌体作为生物催化剂；(4)生物拆分反应：将步骤(3)得到的湿菌体与消旋体β‑内酰胺混合，制得菌体混合液，振荡培养，得到反应液；(5)样品分离：将步骤(4)所述的反应液充分离心，除去菌体，得到上清液，有机溶剂萃取所得物质即为(‑)β‑内酰胺；所述的消旋体β‑内酰胺为3‑羟基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮全细胞拆分后对应于(‑)β‑内酰胺为(3R,4S)‑3‑羟基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮；或所述的消旋体β‑内酰胺为3‑乙酰氧基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮全细胞拆分后对应于(‑)β‑内酰胺为(3R,4S)3‑乙酰氧基‑4‑苯基‑2‑氮杂环丁酮；根瘤菌无菌液体培养基组成包括：氮源：碳源：土壤提取液：蒸馏水为1.0g：10.0g：200ml：800ml，pH 7.2；其中土壤提取液：每25g土壤，加去离子水100ml，105KPa蒸煮1小时，过滤后加水补足到蒸煮前体积；具体制备方法为：将氮源、碳源、土壤提取液溶于去离子水，以NaOH调pH值至7.2，于121KPa灭菌20min，得到所述的根瘤菌发酵培养基；根瘤菌液体培养基的碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一种或几种的混合物；氮源包括胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合物；步骤(4)所述的湿菌体与1～10g/L消旋体β‑内酰胺溶液混合，得到菌体混合液，其中每500ul反应体系中包含60mg湿菌体；所述的消旋体β‑内酰胺溶液为消旋体β‑内酰胺与通用缓冲液，经过超声培养处理后制得；步骤(4)所述的振荡培养的温度为25℃～50℃，pH值5.0～10.0条件下，时间为3h～24h，有氧条件下振荡培养；所述的通用缓冲液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)50mM；硼酸50mM；柠檬酸33mM；Na3PO4 50mM，用HCl或NaOH调pH3～12。