[发明专利]蛇毒丝氨酸蛋白酶Harobin的纯化方法有效
| 申请号： | 201210114817.2 | 申请日： | 2012-04-18 |
| 公开（公告）号： | CN102643791A | 公开（公告）日： | 2012-08-22 |
| 发明（设计）人： | 顾军;洪岸;陈小佳 | 申请（专利权）人： | 暨南大学 |
| 主分类号： | C12N9/64 | 分类号： | C12N9/64;C12R1/84 |
| 代理公司： | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 | 代理人： | 裘晖;陈燕娴 |
| 地址： | 510632 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种蛇毒丝氨酸蛋白酶Harobin的纯化方法。本发明将表达Harobin的毕赤酵母发酵液离心，收集上清，用缓冲液A对上清透析；接着使用依次连接的强阳离子琼脂糖凝胶层析柱和强阴离子琼脂糖凝胶层析柱对透析后的上清进行联合层析，首先用缓冲液A洗至280nm吸收值为0，接着采用缓冲液B进行非特异蛋白洗脱，直至280nm吸收值是0并保持稳定；最后更换缓冲液C进行洗脱，收集缓冲液C洗脱的蛋白样品；将该蛋白样品滴入缓冲液D，使pH值调回7.8～8.2，用缓冲液E透析，冻干，得到Harobin。本发明简单，得到的蛇毒丝氨酸蛋白酶Harobin纯度非常高，可达到95％以上，得率85％以上。 | ||
| 搜索关键词： | 蛇毒 丝氨酸 蛋白酶 harobin 纯化 方法 | ||
【主权项】：
一种蛇毒丝氨酸蛋白酶Harobin的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：(1)将表达蛇毒丝氨酸蛋白酶Harobin的毕赤酵母发酵液离心，收集上清，用缓冲液A对上清透析；(2)通过依次连接的强阳离子琼脂糖凝胶层析柱和强阴离子琼脂糖凝胶层析柱对步骤(1)得到的透析后的上清进行联合层析，首先用缓冲液A洗至280nm吸收值为0，接着用含有0.1M NaCl的缓冲液A对强阴离子琼脂糖凝胶层析柱洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；(3)将含有目的蛋白的洗脱液进行苯甲脒琼脂糖凝胶层析，首先用缓冲液A洗至280nm吸收值为0，接着采用缓冲液B进行非特异蛋白洗脱，直至280nm吸收值是0并保持稳定；最后更换缓冲液C进行洗脱，收集缓冲液C洗脱的蛋白样品；(4)将步骤(3)收集的缓冲液C洗脱的蛋白样品滴入缓冲液D，使pH值调回7.8～8.2；(5)用缓冲液E对步骤(4)最终得到的溶液透析，冻干，得到蛇毒丝氨酸蛋白酶Harobin；所述的缓冲液A为pH 7.8～8.2、15～25mM Tris溶液；所述的缓冲液B为含有0.95～1.05MNaCl的pH 7.8～8.2、15～25mM Tris溶液；所述的缓冲液C为pH 3.1～3.3、45～55mM的甘氨酸溶液；所述的缓冲液D为pH 7.8～8.2、0.95～1.05M Tris溶液；所述的缓冲液E为pH 7.8～8.2、15～25mM Tris溶液。
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