[发明专利]一种检测DNA甲基转移酶基因的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种组合式检测DNA甲基转移酶家族表达的方法。DNA甲基转移酶家族中的各个成员，在不同组织和发育阶段中具有不同的活性和特异性，它们共同作用直接影响着DNA的甲基化状态。所述DNA甲基转移酶指DMT701，DMT702，DMT703，DMT704，DMT705，DMT706，DMT707，DMT708，DMT709，DMT710。本发明通过使用一系列PCR引物，以mRNA反转录产物cDNA为模板，通过特异地结合到模板的保守区或可变区，可以同时检测植物不同组织、不同发育阶段的DNA甲基转移酶家族总表达水平，并可以区分单个家族成员的表达水平。

主权项

一种检测DNA甲基转移酶基因的方法，其特征是主要步骤为：取植物组织，低温研磨成细粉，用不同的常规方法分别提取基因组DNA和总RNA，对提取产物分别进行纯化，得到用于检测的基因组DNA和总RNA样品，对于基因组DNA样品，以它们为模板，分别用十对检测甲基转移酶家族成员的引物进行PCR扩增，检测在所使用的水稻品种/基因型中，是否有这个甲基转移酶家族成员的存在，对于总RNA样品，进行反转录反应，得到cDNA，然后以cDNA为PCR模板，用在此水稻品种/基因型中存在的甲基转移酶引物扩增，PCR产物电泳结果显示为一条带，且其大小比用基因组DNA扩增的产物小约100bp，则总RNA中没有基因组DNA污染；有两条带，且较大条带的分子量与用基因组DNA为模板扩增得到的条带大小完全一致，则在总RNA样品中有基因组DNA污染，要用DNaseI除去污染后，才能用这样的总RNA做模板进行反转录，其产物cDNA用于PCR模板，使用实时荧光定量扩增法，用检测不同甲基转移酶成员的引物进行PCR扩增，定量检测各个成员的表达水平，使用十二对引物，其中十对引物特异地结合甲基转移酶家族内的某一个特定成员，而不会与水稻基因组/转录组中其它任何序列发生错误结合，它们用于检测每种甲基转移酶的表达水平；二对简并引物，DMT_A识别DMT701、DMT702、DMT703、DMT704、DMT707，DMT_B识别DMT706、DMT708、DMT709、DMT710，它们与DMT705引物一起使用，可以检测DNA甲基转移酶家族所有成员的总体表达水平，使用的十二对引物，是以水稻DNA甲基转移酶家族的十个成员的基因组序列和cDNA序列为模板，分别从多个成员共有的保守序列中设计总体表达检测引物，从单个成员特有的序列中设计检测单个成员存在与否及表达程度的引物，并在设计引物时将其放在基因组DNA中某个内含子的两侧，引物设计方法，主要采用通用的引物设计软件Primer premier 5完成，同时以人工判读为辅助，所有引物的长度17～25bp，GC含量40～60％，退火温度57～62℃，扩增cDNA时PCR产物大小200～400bp，扩增基因组DNA或有基因组DNA污染的cDNA时，PCR产物大小300～500bp，用于检测DNA甲基转移酶总体表达水平的引物对，为检测DMT701、DMT702、DMT703、DMT704、DMT707表达水平的DMT_A，以及检测DMT706、DMT708、DMT709、DMT710表达水平的DMT_B：DMT_A：OsDMT_AF：WRTGGTGGSCCTCCRTGTCARGGYOsDMT_AR：YCCWARYGKDRCYTGRTAHYBCAT扩增cDNA时的产物大小为249bp或243bp，模板为DMT702和DMT707或为DMT701，DMT703，DMT704；DMT_B：OsDMT_BF：MTSTWYWSTGGWATTGGAGGTGCAOsDMT_BR：RATMRYYAKGTCAAARCCRCCAAA扩增cDNA时的产物大小为231bp或234bp，模板为DMT706，DMT708和DMT709或为DMT710；DMT701的引物放在第一和第三外显子上，中间隔131bp和97bp的第一、二内含子，及26bp的第二外显子；OsDMT701‑F：GGAGGACTCAGATGACCACTTOsDMT701‑R：GGTAGTGACATCGAGCCTTC无内含子时PCR产物152bp，扩增基因组DNA时产物406bp，DMT702的引物放在第四和第五外显子上，中间隔111bp的第四内含子；OsDMT702‑F：CCTGTGGTGATGATAGAGGGAAOsDMT702‑R：CAAGTCTAACATTGGGCGGTA无内含子时PCR产物157bp，扩增基因组DNA时产物268bp，DMT703引物放在第四和第五外显子上，中间隔183bp的第四内含子；OsDMT703‑F：GGCAGGTTGCTAGAGTTCTTCOsDMT703‑R：TCCTCGGGTCATGTGATTG无内含子时PCR产物118bp，扩增基因组DNA时产物301bp，DMT704引物放在第三和第四外显子上，中间隔111bp的第三内含子；OsDMT704‑F：GGGACTGACCACTGCCACTOsDMT704‑R：CACGCTTGAGATCATGCTTTT无内含子时PCR产物115bp，扩增基因组DNA时产物226bp，DMT705引物放在第一和第二外显子上，中间隔104bp的第一内含子；OsDMT705‑F：GAAAGTCCTCGAGTTCTATAGCGOsDMT705‑R：GTTGGCAACGTCGTTGATG无内含子时PCR产物109bp，扩增基因组DNA时产物213bp，DMT706引物放在第一和第二外显子上，中间隔117bp的第二内含子；OsDMT706‑F：ACAATGATAAGTTCGAGTGGGAOsDMT706‑R：CAGCAACCAAAGCACCTGA无内含子时PCR产物147bp，扩增基因组DNA时产物264bp，DMT707引物放在第一和第二外显子上，中间隔122bp的第一内含子；OsDMT707‑F：CATCAAGTAGTTCTAACCACCAGGOsDMT707‑R：TGTTTTCAAGACAGGCTCACA无内含子时PCR产物182bp，扩增基因组DNA时产物304bp。DMT708引物放在第七和第八外显子上，中间隔36bp的第七内含子；OsDMT708‑F：AGGAAGTGGAACCTTGTCTGGOsDMT708‑R：CCTGCTAACTCCCCTGGTATG无内含子时PCR产物111bp，扩增基因组DNA时产物147bpDMT709引物放在第七和第八外显子上，中间隔407bp的第七内含子；OsDMT709‑F：CTTGGAAGAATGTAGGAAGTGGAOsDMT709‑R：GCCATTAGGGAATATGTCCCTC无内含子时PCR产物199bp，扩增基因组DNA时产物606bp。DMT710引物放在第二和第三外显子上，中间隔136bp的第二内含子；OsDMT710‑F：CTCCAGTCATGTAAGATCACAATTTOsDMT710‑R：CAAAAGAGCCTCCAGTATAGTATCT无内含子时PCR产物115bp，扩增基因组DNA时产物251bp。