[发明专利]一种油菜种子RNA提取的方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种适于油菜种子的RNA提取方法，该方法将热硼酸盐提取缓冲液预热至65℃；再将油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入预热的上述提取缓冲液，继续研磨成匀浆；孵育后用氯化钾沉淀蛋白，再经离心、除杂等步骤得到总RNA。本方法所提取油菜籽总RNA质量完好、没有明显降解现象，OD260/OD280和OD260/OD230均在2.0左右，样品中没有其它杂质如蛋白、盐离子的污染，产物获得率大于40µg/100mg，符合cDNA文库构建的要求。

主权项

一种油菜种子RNA的提取方法，其特征在于包括下述步骤：1）将热硼酸盐提取缓冲液预热至65℃；所述热硼酸盐提取缓冲液成分为：0.2M十水合硼酸钠，30mM乙二醇‑双‑(2‑氨基乙醚)四乙酸，1%（w/v）十二烷基硫酸钠，1%（w/v）脱氧胆酸钠，10mM二硫苏糖醇,1%（v/v）酞菁氧钒,2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮；2）100 mg油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入1ml预热的上述提取缓冲液，继续研磨成匀浆；3）将匀浆转至1.5ml离心管中，42℃恒温摇床孵育1.5h;4)向上述匀浆中加入2M 氯化钾至终浓度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4℃离心；5）转移上清至新的离心管后，加入8M 氯化锂至终浓度2M，冰浴过夜；6）次日，10000rpm，20min，4℃离心，弃上清，沉淀用预冷的2M氯化锂洗涤，10000rpm，15min，4℃离心，弃上清；7）重复上述洗涤步骤2‑3次；8）沉淀溶解于250μl 1×TE缓冲液，10000rpm，15min，4℃离心以去除不溶杂质；9）转移上清至新管中，加入1/10体积的2M 醋酸钾，pH5.5，冰浴15min后10000rpm，15min，4℃离心；10）转移上清至新管，加入1/10体积的3M 醋酸钠，pH6.0；2.5倍体积的冰酒精、2μl肝糖，‑80℃静置1‑2h;11) 13000rpm，15min，4℃离心，沉淀用70%酒精洗涤后，溶解于适量无RNase水中，‑80℃保存备用。