[发明专利]一种油菜种子RNA提取的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种适于油菜种子的RNA提取方法，利用热硼酸盐法提取高质量、高纯度的油菜籽总RNA，以满足新一代测序文库构建、种子发育相关基因的克隆、表达分析及验证对RNA质量的要求。

背景技术

油菜种子中蛋白质、油脂、纤维含量较高，特别在成熟种子中更为严重，而RNA含量相对较低。此外种皮中富含色素、单宁、多酚等代谢产物，这些物质的存在严重影响RNA提取的获得率，而且会直接干扰随后的文库构建、反转录等实验。因此如何提取完整性好、纯度高的RNA是研究油菜种子发育、油脂代谢调控相关基因克隆、表达验证等实验的前提。目前已有大量商品化的试剂盒应用于植物总RNA的提取，如Invitrogen和Fermentas等知名分子试剂公司的试剂盒，其RNA提取质量完好，但价格相对昂贵；Takara的RNA提取试剂盒价格适中，但提取的RNA蛋白和盐离子含量均较高，这些杂质的存在会影响文库构建的效率，很可能导致文库构建的失败，仅能用于反转录等实验，达不到文库构建的要求。不少研究者进行了油菜籽RNA提取方法的探讨，提出了CTAB法、SDS法等等，所提取的RNA可成功用于反转录等，但是否可以应用于cDNA文库构建尚未有报道。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种新的方法，通过热硼酸盐法提取油菜籽总RNA，减少蛋白和盐离子污染，避免其干扰cDNA文库的构建。

本发明所述油菜种子RNA提取方法如下：

1）将热硼酸盐提取缓冲液[0.2M十水合硼酸钠，30mM乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸（EGTA），1%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS），1%（w/v）脱氧胆酸钠，10 mM二硫苏糖醇（DTT）,1%（v/v）酞菁氧钒（IGEPAL CA-630）,2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）]预热至65℃；

2）100 mg油菜籽液氮速冻研磨成粉后加入1ml预热的提取缓冲液，继续研磨成匀浆；

3）将匀浆转至1.5ml离心管中，42℃恒温摇床孵育1.5h;

4)向上述匀浆中加入2M 氯化钾至终浓度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4℃离心；

5）转移上清至新的离心管后，加入8M 氯化锂（LiCl）至终浓度2M，冰浴过夜；

6）次日，10000rpm，20min，4℃离心，弃上清，沉淀用预冷的2M LiCl洗涤，10000rpm，15min，4℃离心，弃上清；

7）重复上述洗涤步骤2-3次；

8）沉淀溶解于250μl 1×TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA,pH，8.0），10000rpm，15min，4℃离心以去除不溶杂质；

9）转移上清至新管中，加入1/10体积的2M 醋酸钾（Kac）（pH，5.5），冰浴15min后10000rpm，15min，4℃离心；

10）转移上清至新管，加入1/10体积的3M 醋酸钠（NaAc）（pH，6.0）、2.5倍体积的冰酒精、2μl肝糖，-80℃静置1-2h;

11) 13000rpm，15min，4℃离心，沉淀用70%酒精洗涤后，溶解于适量无RNase水中，-80℃保存备用。

本方法所提取油菜籽总RNA质量完好、没有明显降解现象，OD260/OD280和OD260/OD230均在2.0左右，样品中没有其它杂质如蛋白、盐离子的污染，产物获得率大于40 μg/100mg，符合cDNA文库构建的要求。

附图说明

图1：不同RNA提取方法的比较

A: 氯化锂-酚方法; 

B: Takara公司提供试剂盒; 

C: 本发明热硼酸方法; 

D: Invitrogen 提供的试剂盒;

M: marker DL2000。

具体实施方式：

将同一批次的油菜籽用4种不同方法提取RNA,提取产物于1%琼脂糖凝胶上60伏（V）电泳40分钟，结果如图1和表1所示。