[发明专利]一种鼠尾胶原蛋白的制备方法

摘要

本发明涉及一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，采用酶法与酸法相混合的新型提取方案，采用不同盐浓度的溶液多次盐析与离心的方法在纯化步骤上大为简化。本发明所使用的制备方法可以从每条鼠尾提取干重为200mg的胶原蛋白，较传统提取的酸溶法每条鼠尾10mg相比可以提高20倍左右，避免了传统方法提取率低、纯化困难、破坏胶原蛋白生物活性等缺点和问题。获得的鼠尾胶原蛋白经过SDS-PAGE鉴定，获得了三条目的条带，与现有SIMGA公司的商业化鼠尾胶原蛋白进行了对比，图谱无差异。经过氨基酸含量分析，制备的鼠尾胶原蛋白质量高，纯度好。

主权项

一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：1)、缓冲溶液的准备和配置：0.1‑5mol/L NaCl溶液、0.01‑0.2mol/LTris‑HCl缓冲盐溶液、0.05‑2mol/L醋酸溶液；2)、从鼠尾中分离出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置与0‑10℃下的0.01‑0.2mol/L Tris‑HCl缓冲盐溶液，所抽提的尾腱呈银白色的丝状；3)、0‑10℃下预处理4‑36小时，期间定时搅拌，除去中性条件下可溶解的糖蛋白和其他杂蛋白；将处理过后的尾腱滤干水分，称重；以每克鼠尾腱配置50mL、置于0‑10℃下的0.05‑2mol/L醋酸溶液；4)、以1∶1000‑1∶50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12‑36小时加完。期间不间断搅拌至所有尾腱均被酶解呈现乳胶状；酶解持续36‑144小时；5)、将乳胶状溶液于0‑10℃条件下离心10‑40分钟，除去不呈现乳胶状的固化物；往乳胶溶液中以1∶0.5‑1∶2的体积配比加入0.01‑0.1mol/L醋酸溶液；搅拌至胶状溶液成分混匀；6)、加入0.1‑5mol/L NaCl溶液至乳胶状溶液并不断搅拌至有白色絮状沉淀在溶液中不再析出为止；高速离心溶液20‑50min；收集沉淀；将乳胶溶液以1∶0.5‑1∶4的体积比的量加入0.1‑5mol/L NaCl溶液，于0‑10℃下放置6‑48h；次日重复步骤6；7)、集中步骤6中收集到的沉淀，用0.01‑2mol/L醋酸溶液重复溶解后加入0.1‑5mol/L NaCl溶液再次析出胶原蛋白；高速离心溶液20‑50min；收集沉淀；重复此步骤1‑5次直至所沉淀的胶原蛋白能够完全溶解；8)、将纯化完全的胶原蛋白用0.01‑2mol/L醋酸溶液充分溶解；灌注于万级分子量截留的透析袋中透析48‑96h；每天换水2‑8次；透析外液用双蒸水进行；9)、将透析完全的胶原蛋白溶液分装入20mL每瓶的小型玻璃瓶，‑40℃‑0℃ 条件下进行冷冻干燥48‑144h，冻干产品即为鼠尾胶原蛋白冻干粉。