[发明专利]一种鼠尾胶原蛋白的制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种鼠尾胶原蛋白的制备方法。尤其涉及一种鼠尾胶原蛋白适合的工业化生产的制备方法。

【背景技术】

胶原蛋白是一种重要的功能性蛋白质，胶原蛋白含有一种独有的氨基酸——羟脯氨酸(Hyp)，胶原蛋白与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑等密切相关，已被广泛应用于医药、食品、日用化工、生物合成等领域，如医用胶囊、食用明胶、照相明胶、化妆品等。鼠尾胶原蛋白是胶原蛋白的一种，主要为I型胶原蛋白。I型胶原主要存在于真皮、腱、骨、牙本质。最普遍的以纤维形式形成胶原，由三股缠绕形成多肽链组。鼠尾胶原蛋白可用于包被细胞培养器皿，培养一些在普通细胞培养器皿中不易贴壁的细胞；也可以用于制备三维胶，模拟真实的生长环境，使细胞在三维环境中生长。目前，提取鼠尾胶原蛋白的研究并不多，主要采用的还是传统的方法，比如酸溶法、碱溶法、超声法、中性盐法、酶法等等，但是都有其缺点。其中酸溶法、碱溶法、超声法、中性盐法不仅存在提取得率低，还可能破坏胶原蛋白的三维立体结构。酶法应用较广，但是除去酶制剂需要酶抑制剂，且操作复杂，同时增加了后期分离纯化鼠尾胶原蛋白的难度。迄今为止，还没有针对鼠尾胶原蛋白进行过大规模制备的相关研究的报道。

【发明内容】

本发明的目的就是为了克服现有制备鼠尾胶原蛋白方法所存在的提取得率低、分离纯化工艺复杂、没有大规模生产的方法等缺点，提供一种工艺简单、提取率高、提取的产品纯度高的鼠尾胶原蛋白的制备方法。

本发明的制备方法包括如下步骤：

1、缓冲溶液的准备和配置：0.1-5mol/L NaCl溶液、0.01-0.2mol/L Tris-HCl缓冲盐溶液、0.05-2mol/L醋酸溶液。

2、从鼠尾中分离出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置与0-10℃下的0.01-0.2mol/L Tris-HCl缓冲盐溶液，所抽提的尾腱呈银白色的丝状。

3、0-10℃下预处理4-36小时，期间定时搅拌，除去中性条件下可溶解的糖蛋白和其他杂蛋白。将处理过后的尾腱滤干水分，称重。以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10℃下的0.05-2mol/L醋酸溶液。

4、以1∶1000-1∶50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小时加完。期间不间断搅拌至所有尾腱均被酶解呈现乳胶状。酶解持续36-144小时。

5、将乳胶状溶液于0-10℃条件下离心10-40分钟，除去不呈现乳胶状的固化物。往乳胶溶液中以1∶0.5-1∶2的体积配比加入0.01-0.1mol/L醋酸溶液。搅拌至胶状溶液成分混匀。

6、加入0.1-5mol/L NaCl溶液至乳胶状溶液并不断搅拌至有白色絮状沉淀在溶液中不再析出为止。高速离心溶液20-50min。收集沉淀。将乳胶溶液以1∶0.5-1∶4的体积比的量加入0.1-5mol/L NaCl溶液，于0-10℃下放置6-48h。次日重复步骤6。

7、集中步骤6中收集到的沉淀。用0.01-2mol/L醋酸溶液重复溶解后加入0.1-5mol/L NaCl溶液再次析出胶原蛋白。高速离心溶液20-50min。收集沉淀。重复此步骤1-5次直至所沉淀的胶原蛋白能够完全溶解。

8、将纯化完全的胶原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解。灌注于万级分子量截留的透析袋中透析48-96h。每天换水2-8次。透析外液用双蒸水进行。

9、将透析完全的胶原蛋白溶液分装入20mL每瓶的小型玻璃瓶，-40℃-0℃条件下进行冷冻干燥48-144h。冻干产品即为鼠尾胶原蛋白冻干粉。

依照本发明专利使用的酸联合酶法提取工艺，每只鼠尾大约可以提取胶原蛋白200mg，与传统的酸溶法、碱溶法及中性盐法相比较(10mg)，提取率有了大幅度的提高。

本发明的鼠尾来自于成年各品系大鼠鼠尾(如ACI、BVF、F344、PA、M520、WAB、WAC、WKA、SD、RF、Wistar等品系)、各品系小鼠鼠尾等(C3H、CBA/N、C57BL/6、C57BL/10、C57L、DBA/2、A、AKR、BALB/c、RF、SWR等品系)。

为了保证制备的鼠尾胶原蛋白的质量，本发明涉及的鼠尾胶原蛋白的提取也可以来自于SPF级(无特定病原体)成年SD大鼠鼠尾。

前述步骤4中胃蛋白酶三次加入的时间和量分别是首次加入三分之一，后1-12小时后加入三分之一，12-36小时后加入剩余三分之一。

前述步骤4中胃蛋白酶的配比为1∶10000，酶解持续72小时。