[发明专利]一种鼠尾胶原蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)、缓冲溶液的准备和配置：0.1-5mol/L NaCl溶液、0.01-0.2mol/LTris-HCl缓冲盐溶液、0.05-2mol/L醋酸溶液；

2)、从鼠尾中分离出鼠尾腱。抽提出的鼠尾腱放置与0-10℃下的0.01-0.2mol/L Tris-HCl缓冲盐溶液，所抽提的尾腱呈银白色的丝状；

3)、0-10℃下预处理4-36小时，期间定时搅拌，除去中性条件下可溶解的糖蛋白和其他杂蛋白；将处理过后的尾腱滤干水分，称重；以每克鼠尾腱配置50mL、置于0-10℃下的0.05-2mol/L醋酸溶液；

4)、以1∶1000-1∶50000的配比分配加入胃蛋白酶，共分三次加入，12-36小时加完。期间不间断搅拌至所有尾腱均被酶解呈现乳胶状；酶解持续36-144小时；

5)、将乳胶状溶液于0-10℃条件下离心10-40分钟，除去不呈现乳胶状的固化物；往乳胶溶液中以1∶0.5-1∶2的体积配比加入0.01-0.1mol/L醋酸溶液；搅拌至胶状溶液成分混匀；

6)、加入0.1-5mol/L NaCl溶液至乳胶状溶液并不断搅拌至有白色絮状沉淀在溶液中不再析出为止；高速离心溶液20-50min；收集沉淀；将乳胶溶液以1∶0.5-1∶4的体积比的量加入0.1-5mol/L NaCl溶液，于0-10℃下放置6-48h；次日重复步骤6；

7)、集中步骤6中收集到的沉淀，用0.01-2mol/L醋酸溶液重复溶解后加入0.1-5mol/L NaCl溶液再次析出胶原蛋白；高速离心溶液20-50min；收集沉淀；重复此步骤1-5次直至所沉淀的胶原蛋白能够完全溶解；

8)、将纯化完全的胶原蛋白用0.01-2mol/L醋酸溶液充分溶解；灌注于万级分子量截留的透析袋中透析48-96h；每天换水2-8次；透析外液用双蒸水进行；

9)、将透析完全的胶原蛋白溶液分装入20mL每瓶的小型玻璃瓶，-40℃-0℃条件下进行冷冻干燥48-144h，冻干产品即为鼠尾胶原蛋白冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于鼠尾来自于成年各品系大鼠鼠尾或各品系小鼠鼠尾。

3.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤4中胃蛋白酶三次加入的时间和量分别是首次加入三分之一，后1-12小时后加入三分之一，12-36小时后加入剩余三分之一。

4.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤4中胃蛋白酶的配比为1∶10000，酶解持续72小时。

5.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤5中离心转速为1000-10000rpm/min，步骤6中高速离心转速为4000-12000rpm/min，步骤7中高速离心转速4000-12000rpm/min。

6.根据权利要求1所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤8中，透析时，采用摇床低速转动，采用硝酸银溶液检验透析外液无沉淀，表明透析完成。

7.根据权利要求1或2所述的一种鼠尾胶原蛋白的制备方法，其特征在于鼠尾来自于SPF级成年SD大鼠鼠尾。