[发明专利]一种培养人角膜缘干细胞植片的方法

摘要

本发明属组织工程学领域，涉及一种以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法。本发明采用生物羊膜作为载体培养角膜缘干细胞；所述的生物羊膜为经钴-60辐照灭菌消毒的冷冻干燥人羊膜，安全性高于去上皮羊膜，且易于保存、方便获取、在临床广泛使用。本发明所述的方法，能避免受体远期感染，且制备过程简单，可减少在取材、处理过程中遭受污染，能更为安全、方便的培养角膜缘上皮细胞，促进人角膜缘干细胞植片的临床应用。

主权项

一种以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织块贴壁将修剪后的生物羊膜上皮面向上，平铺于插入式培养皿的聚碳酸酯膜上，将聚碳酸酯膜放入预置灭活3T3成纤维细胞的培养皿中；无菌条件下将修剪后的角膜缘组织直接放置在完整生物羊膜表面；向培养皿中加入1ml培养液；组织块表面加数滴培养液保持湿润；所用的培养液采用DMEM与F‑12培养基1∶1混合，加入10％胎牛血清，5μg/ml的胰岛素，20ng/ml的重组人上皮细胞生长因子，50IU/ml的青霉素和链霉素；置于37℃，5％ CO2‑95％空气的培养箱中培养；培养液每2～3天更换一次；每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况；(2)包含有培养细胞的生物羊膜和去上皮羊膜的苏木素染色PBS冲洗标本一次，无水乙醇15min，苏木素5min，大量自来水冲洗，晾干、封片；(3)石蜡组织切片的HE染色取含培养细胞的组织，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片；二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗；苏木素染色5min，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30s，提插数下；自来水冲洗15min；置伊红液2min；常规脱水，透明；中性树脂封片，获得人角膜缘干细胞植片。