[发明专利]人牙周膜干细胞库的构建方法

摘要

一种人牙周膜干细胞库的构建方法，本发明包括基本信息采集、牙周膜干细胞获取、牙周膜干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；应用时按照实际需要进行复苏和扩增培养。本发明由废弃的人健康牙齿的牙周膜中获得牙周膜干细胞，利用系统工程，建立有效资源的储备库，储存于库内的人牙周膜干细胞，经短期培养可获得大量富有功能活性的牙周膜干细胞，并能长期保存而不失其活性；与已有技术相比，本发明的构建操作规范，简单容易掌握，安全可行，建库成本低廉，标准化程度高，针对不同年龄段来源的细胞采用不同的冻存液使得复苏后细胞的活性增强，扩大了细胞的来源、增强了细胞的活性。本发明所用的牙齿均为各种原因被拔除废弃的牙齿，大大节约了医疗资源，具有广泛的应用前景。

主权项

一种人牙周膜干细胞库的构建方法，其特征在于，有基本信息采集、牙周膜干细胞获取、牙周膜干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；具体包括：步骤一、采集基本信息：包括检索编码，供体姓名、年龄、身份证号码、出生日期、种族、通讯地址、联系方式、常规检查结果以及后续步骤的相关信息；步骤二、获取牙周膜干细胞：①将供体新鲜牙齿组织采用含V/V为5％～20％新生牛血清的DMEM培养液完成转移，在无菌条件下用PBS液冲洗，在所述含小牛血清的DMEM培养液中刮取牙周膜，并使牙周膜组织成碎块用PBS液冲洗；②在1000～2000转/分钟离心3～10分钟，去除上清液，加入5～10倍体积的消化液后，用吸管吹散均匀，置入37℃孵箱中透气孵育10～60分钟；所述的消化液为3～9U/ml胶原酶溶液与相同体积的0.2～5U/ml分散酶溶液的混合；③孵育完成后，在悬液中加入所述含新生牛血清的DMEM培养液，吹散组织细胞悬液阻止消化，在800～2000转/分钟离心3～10分钟，弃上清后，加入5～10倍体积的完全培养基重悬细胞，转入培养瓶中进行原代培养，期间1～4天换液一次；④培养7～9天后用3～9U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80～90％时，采用磁珠分离法分离出牙周膜干细胞；采用干细胞标志物对所得到的细胞进行鉴定，再采用细胞工厂进行扩增培养；步骤三、牙周膜干细胞冻存、入库：将所获得的牙周膜干细胞按2×107～9×107个/ml的密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，在0～4℃条件下以0.5～2℃/分钟的速度冷冻至-80～-120℃；再将冻存管转移至-196℃液氮中贮存入库；步骤四、信息记录与核对：在贮存入库的容器载体上建立相关信息，将前述所采集供体基本信息和相应牙周膜干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，纳入细胞库管理；即完成人牙周膜干细胞库的构建。