[发明专利]一种提高红豆杉内生真菌发酵物中紫杉醇产率的方法

摘要

一种提高红豆杉内生真菌发酵物中紫杉醇产率的方法，本方法利用产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体10－去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III分别单独培养，然后将培养物进行混合培养，并适当补加培养基，大幅度提高发酵物中紫杉醇的产率。本方法的优点在于利用两种同类真菌代谢途径互补大幅提高发酵物中紫杉醇的含量，大大高于产紫杉醇内生真菌单独培养的产率水平。使利用内生真菌进行工业化发酵培养生产紫杉醇成为可能。本方法不但适用于产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中紫杉醇含量。也适宜于产生天然有用成分的内生真菌与产生天然有用成分合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中天然有用成分的含量。

主权项

1、一种提高红豆杉内生真菌发酵物中紫杉醇产率的方法，其特征在于：将产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III内生真菌的培养物进行混合培养，大幅度提高发酵物中紫杉醇的产率，步骤如下：(1)培养基制备①PDA培养基：②发酵培养基：葡萄糖2-10g/L 蔗糖10-20g/L 蛋白胨0.5-2.5g/L醋酸钠0.5-3g/L MgSO4 2-5mg/L Ca(NO3)25-100mg/LCuSO4 0.5-300mg/L ZnSO4 0.5-200mg/L MnCl2 1-25mg/LFeCl3 0.5-10mg/L KH2PO4 10-350mg/L 维生素B1 0.5-10mg/L维生素B6 0.5-30mg/L 苯丙氨酸0.5-5mg/L 苯甲酸钠50-1000mg/L乙酰水杨酸钠0.01-5mg/L 甲醇5-20ml/L 油酸1-10ml/L，pH 6.8；(2)菌体预培养；分别挑取产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III内生真菌和产紫杉醇内生真菌的菌丝接种于含50ml PDA培养基的发酵瓶中，培养形成种子发酵液；(3)菌体生长培养：分别将上述两种真菌的种子发酵液接种于含500ml发酵培养基的摇瓶中，培养得到含菌体和培养液的真菌菌液；(4)将上述两种发酵物(既真菌菌液)进行混合培养生产紫杉醇：将生长好的产紫杉醇内生真菌菌液与产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III内生真菌菌液按1∶0.5～4.0的体积份数比混合，补加总体积的0.5-1.0倍的发酵培养基培养；(5)紫杉醇提取：将发酵物4000rpm离心15min，上清液和低温冻溶的菌体加等体积的乙酸乙酯超声波萃取1h，重复提取2次；合并所有乙酸乙酯层，于50℃旋转蒸干，甲醇洗涤，加入二氯甲烷和水1∶1(v/v)萃取后，将二氯甲烷蒸干，准确量取1ml乙醇溶解得到紫杉醇样品；(6)含量检测：紫杉醇样品过滤后上高效液相色谱柱，于228nm做定性及定量检测。