[发明专利]NF－κB检测双链DNA微阵列芯片及制备

摘要

本发明在固相支持物(solid substrates)表面制备一种双链脱氧核糖核酸(double－strandedDNA，dsDNA)微阵列(microarray)，使其dsDNA探针(probes)上嵌合核因子κB(nuclear factorκB，NF－κB)的序列特异性DNA结合位点(sequence－specific DNA－binding sites)，用以高通量检测(high－throughput detecting)细胞核内NF－κB的含量及筛选dsDNA/NF－κB相互作用干扰性分子(molecules interferingdsDNA/NF－κB interaction)。本发明首先依靠专利技术(中国专利02112780.8及02137945.9)及其它本发明提出的方法，在固相支持物表面制备dsDNA微阵列，使该dsDNA微阵列上的大量dsDNA探针上含有NF－κB的序列特异性DNA结合位点，再将该dsDNA微阵列与特定细胞核蛋白或NF－κB纯蛋白杂交结合，通过NF－κ、B与微阵列靶点dsDNA的相互作用，实现对特定细胞核中NF－κB蛋白的定性或定量测定，或通过检测在外源分子，如组合化学分子、天然生物分子的存在下，NF－κB与微阵列靶点dsDNA相互作用特征的改变，筛选能够干扰NF－κB与其靶点dsDNA的相互作用的分子，特别是能够降低NF－κB与其靶点dsDNA结合亲合性(binding affinity)的组合化学或天然生物小分子。本发明制备的NF－κB检测dsDNA微阵列芯片，在基础分子生物学研究，特别是NF－κB相关基因表达调控和生物医学研究，如NF－κB相关疾病药物作用机理研究和药物性分子筛选中有广泛而重要的应用价值。

主权项

1、一种检测核因子-κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)的双链DNA微阵列芯片(double-stranded DNA microarray chip，dsDNA microarray chip)及其制备(Fabrication)方法，其特征在于该微阵列芯片具有如下结构、功能及制备特征：(a)NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的结构特征：NF-κB检测dsDNA微阵列芯片由固相支持物及固定在固相支持物表面的dsDNA微阵列构成，该dsDNA微阵列由大量固定在固相支持物表面的dsDNA探针分子文库(library)组成，文库中不同的dsDNA探针分子上有DNA序列不同的NF-κB转录因子结合位点(DNA-binding sites)。(b)NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的功能特征：NF-κB检测dsDNA微阵列芯片可以依靠序列特异性DNA结合蛋白NF-κB转录因子与芯片dsDNA探针分子上NF-κB的DNA结合位点发生结合反应，实现对被检测物中NF-κB蛋白的高通量检测，发挥多项生物功能，包括：①确定特定细胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表达种类；②确定特定细胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白如Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表达水平和活化程度；③确定不同NF-κB/Re1家族蛋白与大量突变型及野生型dsDNA靶点的相互作用的特异性与亲合性特征；④确定NF-κB/Re1蛋白与大量突变型及野生型dsDNA靶点相互作用的碱基和氨基酸键合规律；⑤确定NF-κB/Re1蛋白dsDNA结合靶点的碱基组成矩阵(matrix)，预测新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA结合靶点，并从全基因组DNA序列中搜索预测的新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA结合靶点，寻找这些dsDNA结合靶点的上、下游基因，研究这些基因是否受到NF-κB/Re1蛋白的表达调控，从而鉴定新的NF-κB/Re1蛋白调控基因；⑥通过鉴定新的NF-κB/Re1蛋白调控基因，并结合已知的NF-κB/Re1蛋白调控基因，构建全基因组NF-κB/Re1蛋白基因表达调控网络；⑦筛选NF-κB/Re1蛋白dsDNA靶点序列特异性结合组合化学分子及天然生物分子；⑧筛选NF-κB/Re1蛋白与dsDNA靶点相互作用干预性组合化学分子及天然生物分子。(c)NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的制备方法：NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的制备方法包括如下9种：①固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，通过液相复性成为双分子(bimolecular)双链寡核苷酸，再点样连接固定到固相基质表面，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸复性点样法)；②固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，先将其中化学修饰的一条寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面，形成单链DNA微阵列芯片，再用互补的另一条寡核苷酸杂交复性成为双分子(bimolecular)双链寡核苷酸，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸点样复性法)；③固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物，先将化学修饰的较长寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面，形成单链DNA微阵列芯片，再与通用引物寡核苷酸杂交复性成为部分双分子(partialbimolecular)双链寡核苷酸，再用DNA聚合酶进行在片延伸反应，使部分双分子双链寡核苷酸成为完整双分子(complete bimolecular)双链寡核苷酸，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸通用引物点样复性延伸法)；④固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物，先将化学修饰的较长寡核苷酸与通用引物寡核苷酸在液相杂交复性成为部分双分子(partial bimolecular)双链寡核苷酸，将复性产物点样连接固定到固相基质表面，形成部分双分子双链寡核苷酸微阵列芯片，再用DNA聚合酶进行在片延伸反应，使部分双分子双链寡核苷酸成为完整双分子(complete bimolecular)双链寡核苷酸，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸通用引物复性点样延伸法)；⑤固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物，先将化学修饰的较长寡核苷酸与通用引物寡核苷酸在液相杂交复性成为部分双分子(partial bimolecular)双链寡核苷酸，再用DNA聚合酶进行延伸反应，使部分双分子双链寡核苷酸成为完整双分子(complete bimolecular)双链寡核苷酸，将延伸产物点样连接固定到固相基质表面，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸通用引物复性延伸点样法)；⑥合成一条长寡核苷酸，使寡核苷酸含有两段链内反向互补序列，且反向互补序列内含有NF-κB结合位点，将复性寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片，通过变性再复性成为单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片；此法也可以先在液相进行变性再复性，然后点样连接固定到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片(单分子链内互补法)；⑦合成一条较短的寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点，并且在其3′端(羟基)含有两段链内反向互补序列，将寡核苷酸点样连接固定(5′端)到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片，再通过变性、再复性和DNA聚合酶进行在片延伸反应，制备单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(单分子点样复性发卡引物延伸法)；⑧合成两条寡核苷酸，使其中寡核苷酸1含有NF-κB结合位点，并且在其磷酸化的3′端含一段核苷酸序列，该段核苷酸能够与寡核苷酸2的3′端一段核苷酸序列互补；寡核苷酸2在5′端含有两段链内反向互补序列，且两段链内反向互补序列间有一个或多个C3dT氨基或其他化学修饰基团；在液相内将两条寡核苷酸复性后点样连接固定(C3dT氨基或其他化学修饰基团)到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片；再通过DNA聚合酶进行在片延伸反应，制备单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(单分子复性连接点样发卡引物延伸法)；⑨合成一条较长寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点，并且在其3′端(羟基)含两段链内反向互补序列，且两段链内反向互补序列间有一个或多个C3dT氨基或其他化学修饰基团；将寡核苷酸复性后点样连接固定(C3dT氨基或其他化学修饰基团)到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片；再通过变性、再复性和DNA聚合酶进行在片延伸反应，制备单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(C6dT单分子点样复性发卡引物延伸法)。