本发明公开了一种鱼用DNA疫苗及其制备方法与应用,属于生物医药技术领域。所述的鱼用DNA疫苗为含有Z‑DNA序列的重组质粒与含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒的混合物;其中所述的含有Z‑DNA序列的重组质粒与所述的含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒之间的质量比为1:1;所述的含有Z‑DNA序列的重组质粒的序列如SEQ ID NO.1所示;所述的含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明制备的DNA疫苗能显著激活鱼体先天免疫反应,对GCRV病毒引起的鱼体死亡具有良好的保护效果,免疫保护率达60.2%,为后期DNA疫苗的应用及产业化提供理论基础和科学依据。