本发明公开了重症免疫缺陷猪源重组细胞及其制备方法。具体来说，本发明涉及IL2RG基因、RAG1基因和RAG2基因这三个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞，以及用于制备该重组细胞的方法，以及用于制备该重组细胞的试剂盒。本发明提供了sgRNA组合，由sgRNAIL2RG‑g7、sgRNARAG1‑g4和sgRNARAG2‑g2组成。sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：24中第1‑20位核苷酸所示。sgRNARAG1‑g4的靶序列结合区如SEQ ID NO：9中第1‑20位核苷酸所示。sgRNARAG2‑g2的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1‑20位核苷酸所示。本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。
本发明公开了一种CRISPR/Cas9系统及其在构建抗肌萎缩蛋白基因缺陷的猪源重组细胞中的应用。本发明提供了sgRNA组合，由sgRNADMD‑Ug3(靶序列结合区如SEQ ID NO：8中第1‑20位核苷酸所示)和sgRNADMD‑Dg3(靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1‑20位核苷酸所示)组成。本发明提供了试剂盒，由转录得到sgRNADMD‑Ug3的质粒pKG‑U6gRNA(DMD‑Ug3)、转录得到sgRNADMD‑Dg3的质粒pKG‑U6gRNA(DMD‑Dg3)和质粒pKG‑GE3组成。所述sgRNA组合或所述试剂盒可用于制备重组细胞或制备杜氏肌营养不良症动物模型。所述重组细胞为抗肌萎缩蛋白基因缺陷的细胞，可用于体细胞克隆制备动物疾病模型。本发明为杜氏肌营养不良症猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于杜氏肌营养不良症药物的研发具有重大应用价值。
本发明公开了IL2RG基因和ADA基因联合敲除的重组细胞及其在制备免疫缺陷猪模型中的应用。本发明提供了由sgRNAIL2RG‑g7和sgRNAADA‑g7组成的sgRNA组合在制备试剂盒中的应用。本发明还提供了一种sgRNA组合，由sgRNAIL2RG‑g7和sgRNAADA‑g7组成。所述sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：12中第1‑20位核苷酸所示；所述sgRNAADA‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：22中第1‑20位核苷酸所示。本发明还保护所述sgRNA组合在制备重组细胞中的应用以及在制备免疫缺陷动物模型中的应用。本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。
本发明公开了一种CRISPR/Cas9系统及其在制备TTN基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞中的应用。本发明提供了一种sgRNA，命名为sgRNATTN‑E278‑g2，其靶序列结合区如SEQ ID NO：7中第1‑20位核苷酸所示。本发明还提供了一种质粒，命名为质粒pKG‑U6gRNA(TTN‑E278‑g2)，其转录得到sgRNATTN‑E278‑g2。本发明还保护sgRNATTN‑E278‑g2或质粒pKG‑U6gRNA(TTN‑E278‑g2)在制备扩张型心肌病猪模型或扩张型心肌病猪细胞模型中的应用。本发明为扩张型心肌病猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于扩张型心肌病药物的研发具有重大应用价值。
本发明公开了一种用于制备LMNA基因突变的扩张型心肌病克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用。本发明提供了一种试剂盒，包括sgRNALMNA‑E7‑g1或质粒pKG‑U6gRNA(LMNA‑E7‑g1)。sgRNALMNA‑E7‑g1，的靶序列结合区如SEQ ID NO：6中第1‑20位核苷酸所示。质粒pKG‑U6gRNA(LMNA‑E7‑g1)，其转录得到sgRNALMNA‑E7‑g1。本发明还保护一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将质粒pKG‑U6gRNA(LMNA‑E7‑g1)和质粒pKG‑GE3共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明为通过基因编辑手段获得扩张型心肌病猪模型奠定了坚实的基础，本发明对于扩张型心肌病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了用于构建LMNA基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。用于构建LMNA基因突变的基因编辑系统，其特征在于包含Cas9蛋白、LMNA‑T7‑gRNA1、LMNA‑T7‑gRNA3；所述的LMNA‑T7‑gRNA1的转录模板如SEQ ID NO.24所示，LMNA‑T7‑gRNA3的转录模板如SEQ ID NO.25所示；所述的基因编辑系统还包含核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的单链DNA作为Donor DNA。利用本发明所得到的靶基因突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。
本发明公开了用于OCA2基因突变的CRISPR系统及其在构建白化病克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于OCA2基因编辑的gRNA，序列如SEQ ID NO：39所示。一种针对猪OCA2基因的gRNA表达载体，以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG‑U6gRNA为载体骨架，表达所述的gRNA。一种用于猪OCA2基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和所述的针对猪OCA2基因的gRNA表达载体。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。
本发明公开了一种CRISPR系统及其在构建GABRG2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪GABRG2基因编辑的CRISPR/cas9系统，包含序列如SEQ ID NO.2所示的Cas9高效表达载体pKG‑GE3和针对猪GABRG2基因的gRNA表达载体，该载体以序列如SEQ ID NO.3所示的pKG‑U6gRNA为载体骨架，表达序列如SEQ ID NO.35所示的gRNA。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。
