本发明公开了一种用于同时检测幽门螺旋杆菌及其耐药基因的多重荧光PCR试剂,所述试剂包括如下引物对和探针:由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌的引物对A;由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因引物对B;由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两个单链DNA组成的检测幽门螺旋杆菌左氧氟沙星耐药基因引物对C。本发明PCR检测试剂可实现在一管中同时检测幽门螺旋杆菌和两个耐药基因(10个突变位点)及一管内参基因,有效改善多对引物和探针之间的干扰,有效提高了检测灵敏度和特异性,为临床治疗幽门螺旋杆菌耐药基因的检测提供快速、高效的方法。