本发明公开了一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用,属于生物工程领域。甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将甲酸脱氢酶突变体的目的基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌,通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺,实现重组甲酸脱氢酶的制备,并将其应用于生物催化反应制备(3R,5R)‑3,5‑二羟基己酸酯类化合物。本发明提供了一种催化活性和酶稳定性均较好的甲酸脱氢酶突变体,可用于(3R,5R)‑3,5‑二羟基己酸酯类化合物的合成,能够大幅度提高底物的转化率,得到高光学纯度的产品,极大地降低了医药中间体的生产成本。