本发明涉及体外诊断技术领域,尤其是一种果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt及其制备方法和应用,其蛋白序列如SEQ ID No:1所示,编码该果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt的基因核酸序列如SEQ ID No:2所示。本发明的果糖赖氨酸氧化酶突变体FODt,其催化能力较野生型提高了2倍左右,使其用量降低约50%,大大降低了人体血糖检测成本,将有利于改进果糖赖氨酸氧化酶的人体血糖水平的检测水平,提高试剂的反应灵敏度,提升试剂的在机稳定性,延长了试剂使用的寿命,提高了检测终端的试剂利用率,大大降低了使用成本,实现了产品高效环保生产。